人羊膜上皮细胞抗细胞衰老作用的研究进展

尉迟海深, 林金德



综 述

人羊膜上皮细胞抗细胞衰老作用的研究进展

尉迟海深, 林金德

人羊膜上皮细胞; 细胞衰老; 抗衰老

细胞衰老是细胞在执行生命活动过程中，随着时间的推移，细胞增殖与分化能力和生理功能逐渐发生衰退的变化过程。人们对细胞衰老机制的研究由来已久，目前主要有差错理论、程序理论及端粒学说。细胞衰老可以促使生物衰老，不仅可以导致组织器官功能减弱与丧失，而且与恶性肿瘤、心衰、糖尿病等多种重要疾病的发生有关。因此，深入研究细胞衰老和抗衰老的机制有着重要意义。近年来，国内外大量的实验研究表明[1-7]，人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells, HAECs)具有较强的抑制细胞分化、促进细胞增殖、增强细胞活力和功能、保护细胞免受不良影响的伤害，以及抑制细胞凋亡的作用，为抗细胞衰老研究提供了崭新的路径。现笔者就HAECs的生物学特性，以及其用于抗细胞衰老的研究方法和成果作一综述。

1 HAECs的生物学特性

HAECs存在于分娩后胎盘上的羊膜组织中，是由受精卵发育至第8天的囊胚内细胞团分化而来，具有分化潜能，可向3个胚层组织分化。在合适的诱导条件下，HAECs可分化为肝细胞、心肌细胞、神经细胞等。它是一类具有干细胞特性的上皮细胞，表达干细胞标志分子及相关基因，如CD133，CD271，TRA-1-60,Oct3/4，SOX-2，SSEA-4和Klf 4[8]，但不表达干细胞中的端粒酶基因。端粒酶可以保护染色体的末端，保证DNA不在复制过程中缩短，从而使细胞永生化。因此，HAECs不能无限增殖，不能看做严格意义上的干细胞。细胞表面不表达HLA-A、B、C和DR抗原，因抗原性极低，同种异体移植后不会引起免疫排斥反应。1998年，K Imakawa等研究发现，羊膜可分泌大量的细胞因子，如表皮生长因子、肝细胞生长因子、角质细胞生长因子、神经营养因子(神经营养素、神经细胞分裂素、成纤维细胞生长因子、胶质源性神经营养因子、胰岛素样生长因子等)、转化生长因子-β、碱性成纤维细胞生长因子等，这些生长因子均有一定的促进细胞增殖和抗衰老作用。另外，如白细胞介素-1受体拮抗剂、白细胞介素18等抗凋亡因子在HAECs中也有较强表达。HAECs的抗衰老作用主要通过这些可溶性生物因子而发挥作用。

2 HAECs对细胞衰老的影响

大量方法用于研究HAECs对细胞衰老的影响[1,9-14]，概括起来主要包括：⑴条件培养液。在细胞培养过程中，细胞会分泌活性物质到培养液中，这种培养过某种细胞以后含有该种细胞分泌物的培养液，叫做该种细胞的条件培养液。条件培养液的制备大致包括：细胞培养、收集上清液、离心除去细胞碎屑、浓缩保存等步骤。人羊膜上皮细胞条件培养液(human amniotic epithelial cells conditioned medium, AMCM)保留了细胞在生长过程中分泌的全部细胞因子，含量最为丰富，使用方便，应用较为广泛。⑵饲养层细胞。在正常机体内，细胞除了获得一些来自血液的营养外，还在细胞与细胞之间互换特殊的物质，用于分裂、分化和营养等。因而，在细胞体外培养中，除了正常的培养基外，先培养一层特殊的细胞，然后再在其上接种要实验的细胞，这些特殊的细胞就是饲养层细胞。该细胞可以提供给实验细胞更好的营养，而大多数的分化研究则必须有饲养层细胞。以HAECs作为饲养层细胞，主要用于研究前者对其他细胞分化的影响。⑶细胞移植。HAECs也可用于活体实验，成功移植并存活于实验动物体内的HAECs，主要通过旁分泌的方式发挥作用。⑷去细胞羊膜。去细胞羊膜是将新鲜羊膜组织用中性蛋白酶消化去除上皮细胞层，便于储存。去细胞羊膜组织中吸收了羊膜上皮细胞分泌的大量有活性的细胞因子，且不易流失。⑸羊膜提取液。将羊膜组织中所吸收的羊膜上皮细胞分泌的细胞因子重新溶解释放，获得的羊膜提取液，也广泛用于研究。

3 HAECs的抗衰老作用与机制

3.1 抑制细胞分化 HAECs作为饲养层细胞培养人角膜上皮祖细胞，比传统的3T3生物饲养层能更有效地促进集落的生长[1]。这些细胞体积更小，保持更强的增殖能力，且具有更高水平的干细胞相关标志分子表达，如P63、Mucashi-1和ABCG2等。Lai等[2]的研究显示，培养在HAECs上的胚胎干细胞可以保持未分化状态而长时间生长，保持原代细胞的细胞形态和分子标志，在抑制细胞分化方面较传统的鼠胚胎成纤维细胞饲养层更具优势。羊膜来源于多潜能祖细胞与单核细胞共培养，前者可明显抑制单核细胞向树突状细胞的分化成熟。共培养环境中的单核细胞保留了未分化的标志分子CD14，同时由单核细胞分化的树突状细胞的成熟标志分子CD83、CD1a也明显减少，这表明羊膜来源多潜能祖细胞对单核细胞向树突状细胞分化的抑制作用[3]。

HAECs抑制细胞分化的作用机制之一，与其分泌的白细胞介素抑制因子(Interleukin inhibitory factor， LIF)有关[5]。以高表达LIF的HAECs作为饲养层细胞，培养精原干细胞；精原干细胞可以长时间培养，并保持未分化状态。与表达较少的LIF人羊膜上皮饲养层细胞相比，高表达LIF的HAECs可使精原干细胞表达更多的特异性干细胞表面标志。最近的研究还显示，HAECs作为饲养层细胞培养，可通过抑制诱导性多功能干细胞(iPSCs)内源性DNA甲基转移酶的生成来抑制其分化，保持其多分化潜能、旺盛的增殖潜能和自我更新能力[5]。

3.2 促进细胞增殖 与培养在普通培养液中的角膜上皮细胞相比，加入20%的AMCM后，细胞的增殖能力、集落形成能力明显提高。细胞周期中，G1期比例明显下降，G2期、S期比例明显上升，并且表现出与原代细胞相似的细胞间连接和细胞泵功能[6]。近期，关于HAECs促进皮肤再生的研究也表明，HAECs可促进Ki-67阳性细胞的比例，表明细胞的增殖能力提高[7]。

2006年，JH Lee 等认为，AMCM可促进角膜上皮细胞的增殖能力和DNA合成能力；进一步研究显示，AMCM可促使角膜上皮细胞自身合成和分泌胰岛素样生长因子-1(IGF-1)，呈时间-剂量依赖关系，即在一定范围内，随着AMCM浓度的升高和作用时间的延长，角膜上皮细胞合成的IGF-1逐渐增加；角膜上皮细胞合成的IGF-1是促进自身增殖能力的重要机制。另外，这种促进细胞增殖的作用，也可能与HAECs使其他细胞的细胞增殖相关蛋白，如细胞周期蛋白D1，D3和MDM2表达水平增高有关[9]。

3.3 增强细胞活力与功能 国外学者的研究表明[10]，将视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium cells， RPE)接种在去细胞羊膜上生长，用real time-PCR定量分析与RPE细胞特异功能密切相关的数个基因的表达情况，如RPE65、CRALBP、Bestrophin氯离子通道蛋白和酪氨酸酶相关蛋白，与生长在塑料培养皿上的细胞相比，这些特异性基因的表达水平明显上调，表明羊膜(amniotic membrane, AM)可以抑制RPE细胞功能的退化，

Skvorak 等[11]的细胞移植实验，从细胞的新陈代谢方面阐释了部分机制。HAECs移植入鼠体内后，可影响细胞的新陈代谢，使模型鼠受损神经细胞与能量代谢相关的多种氨基酸含量和与蛋白质代谢(尿素循环)相关的多种氨基酸含量有明显改善。受损神经细胞受HAECs影响后，其合成5-羟色胺、多巴胺、γ氨基丁酸等神经递质的能力明显恢复。Xiao 等[12]则证明，AMCM可明显增加角膜上皮细胞生物膜表面的钠泵、水通道蛋白等多种离子通道蛋白，这些蛋白通道在保持细胞正常体积方面发挥着决定性的作用，其可以清除多余的水和多种离子，使细胞保持旺盛的活力和功能。3.4 保护作用和抑制细胞凋亡 2003年，S Uchida 等研究表明，视网膜神经元细胞在无血清培养液中加入AMCM后，恶化的细胞形态得到明显改善，细胞的存活率明显提高，而且比加入几种重要的神经营养因子，如脑源性神经营养因子、睫状神经营养因子、神经营养因子-3(NT-3)等的效果要好数倍。同年，K Kakishita等研究表明，AMCM可明显增加多巴胺神经元细胞无血清培养液中的存活率，并可保护细胞形态的完整性免受毒物6-羟基多巴的破坏；HAECs移植入脑内后，可发挥保护作用，与对照组相比，受毒物影响的多巴胺神经元的存活率明显提高。HAECs移植，还可以减轻机械拉力造成的神经纤维损伤。将HAECs移植在拉伤的臂丛神经组织周围，可使神经纤维的机械抗拉性能和病理形态得到明显改善，受损的神经传导功能也可显著恢复[13]。

HAECs抑制细胞凋亡的作用机制较复杂。Xiao等[12]研究表明，AMCM可明显减少角膜上皮细胞的细胞内活性氧族的含量，减少氧自由基对DNA的破坏和细胞代谢活动的不利影响；并可抑制细胞凋亡相关蛋白P53的表达，抑制P53引发的细胞凋亡通路，增加抑制凋亡相关蛋白Survivin的表达。2006年，CC Sun等通过反转录PCR、定量PCR和酶联免疫分析的方法表明，去细胞羊膜可促使角膜上皮细胞表达大量的白细胞介素-1受体抑制剂，通过此路径抑制角膜上皮细胞的凋亡。2003年，马翔等研究发现，AMCM对肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的角膜基质细胞凋亡有明显的抑制作用，并发现受HAECs影响后，角膜基质细胞的Bcl2基因表达明显增加，推测凋亡抑制相关基因Bcl2在此过程中发挥重要的作用。最新的关于HAECs移植抑制卵巢颗粒细胞凋亡的研究同样发现，HAECs移植后，颗粒细胞Bcl2基因表达明显增加，Caspase-3、Bax基因表达明显减少，Bcl2/Bax的比例升高，验证并补充了前人的研究成果[14]。

综上所述，HAECs是一种具有干细胞特性和很高分化潜能的新型细胞，抗原性极低，同种异体移植后不会引起免疫排斥反应；其可以旺盛地分泌多种细胞因子，这些细胞因子是其发挥抗衰老作用的基础。大量的研究表明，其抗衰老作用具体表现在抑制细胞分化、促进细胞增殖、增强细胞活力和功能、保护细胞免受不良影响的伤害和抑制细胞凋亡等方面。尽管HAECs产生的抗衰老因子有待于进一步鉴定，以及其单独的作用机制和合力作用机制有待于进一步研究，但HAECs作为一种新的富有希望的研究对象，必将对抗衰老的实验研究和临床研究产生深远的影响。

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210009 江苏 南京，南京医科大学附属友谊整形外科医院 整形外科

尉迟海深(1988-)，男，河南南阳人，硕士研究生.

林金德，210009 ，南京医科大学附属友谊整形外科医院 整形外科，电子信箱：hzljd@sohu.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.05.016

2016-03-14)