新型香豆素类酰腙－铜配合物对肺腺癌A549细胞的体内外抑制作用

新型香豆素类酰腙—铜配合物对肺腺癌A549细胞的体内外抑制作用

陆勤1，欧秋霞2，朱文娇1，朱涛峰1

(1宜兴市人民医院，江苏宜兴214200；2宜兴市和桥医院)

摘要：目的观察新型香豆素类酰腙—铜配合物(以下缩写为CCCD)在体内外对肺癌A549细胞的抑制作用，并探讨其机制。方法培养肺癌A549细胞，分别加入5、10、20、30、50、80、120、160 μmol/L的CCCD，干预72 h后，采用MTT法，计算细胞生长抑制率(IR)。将A549细胞分为干预组、对照组，干预组分别加入10、20、40 μmol/L CCCD，对照组加入PBS，采用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况并计算细胞凋亡率，采用Western blot法检测各组细胞Caspase-3蛋白表达。取18只裸鼠建立肺癌荷瘤鼠模型，分为观察1组、观察2组、对照组，每组各6只，分别予尾静脉注射4、8 mg/kg CCCD及PBS，1次/周，共干预3周，干预结束后测算各组肿瘤体积并计算抑瘤率。随后处死各组裸鼠，取瘤体组织，应用TUNEL法检测各组肿瘤细胞凋亡情况并计算凋亡指数(AD)。结果加入5、10、20、30、50、80、120、160 μmol/L CCCD后，A549细胞IR分别为8.80%、16.52%、37.24%、55.75%、77.22%、87.16%、95.25%、98.70%，随着药物浓度增高，IR呈增高趋势。干预组加入10、20、40 μmol/L CCCD后，细胞凋亡率均高于对照组(P均<0.05)。干预组Caspase-3蛋白表达高于对照组(P<0.05)。观察1组、观察2组、对照组AD分别为16.83%±8.44%、24.65%±11.24%、3.30%±2.12%，各组间比较P均<0.05。观察1组、观察2组抑瘤率分别为51.08%、56.78%。结论 CCCD在体内外均可抑制肺癌A549细胞的生长，促进细胞凋亡，其作用机制可能与经Caspase-3途径诱导细胞凋亡有关。

关键词：肺癌；香豆素类酰腙酰腙—铜配合物；细胞增殖；细胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.42.006

中图分类号：R734.2；R979.1 文献标志码：A

基金项目：江苏大学医学临床科技发展

作者简介：第一陆勤(1981-)，女，主治医师，研究方向为肺癌的诊断与治疗。E-mail: luqinyx@sina.com

作者简介：通信朱涛峰(1983-)，女，主治医师，研究方向为肺癌的诊断与治疗。E-mail: 48506822@qq.com

收稿日期：(2015-07-01)

Inhibitory effect of new copper (Ⅱ) complex with coumarin derivatives

on lung cancer cells A549 in vivo and vitro

LUQin1, OU Qiu-xia, ZHU Wen-jiao, ZHU Tao-feng

(1YixingPeople′sHospital,Yixing214200,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the inhibitory effect of a new copper (Ⅱ) complex with coumarin derivatives (CCCD) on lung cancer cell line A549 in vivo and in vitro and to investigate the mechanism. MethodsThe lung cancer A549 cells were cultured and were treated with 5, 10, 20, 30, 50, 80, 120, 160 μmol/L CCCD for 72 h, then the inhibition rate (IR) of tumor cells was calculated by using MTT assay. A549 cells were divided into the intervention group which was treated with 10, 20 and 40 μmol/L CCCD and the control group which was treated with PBS. The apoptosis and the apoptosis rate were analyzed by flow cytometry, and the expression of caspase-3 was detected by Western blotting. Furthermore, 18 tumor-bearing nude mice were divided into the observation group 1, observation group 2 and the control group, which were treated with 4, 8 mg/kg CCCD and PBS once a week for three weeks, and then they were executed to detect the tumor volume and tumor inhibition rate. After that, the tumor tissues were obtained to detect the apoptosis and apoptosis index (AD) by TUNEL method.ResultsThe inhibition rates of A549 cells were 8.80%, 16.52%, 37.24%, 55.75%, 77.22%, 87.16%, 95.25% and 98.70% after being treated with 5, 10, 20, 30, 50, 80, 120 and 160 μmol/L CCCD. The IR showed an increased tendency with the increased concentration of the drugs.And being after treated with 10, 20 and 40 μmol/L CCCD, the apoptosis rate and expression level of caspase-3 in the intervention group were significantly higher than those of the control group (all P<0.05). The AD in the observation groups 1, 2 and the control group were 16.83%±8.44% , 24.65%±11.24% and 3.30%±2.12% (all P<0.05). And the tumor inhibition rates in the observation groups 1 and 2 were 51.80% and 56.78%, respectively. ConclusionsCCCD may inhibit the growth of A549 cells in vivo and in vitro and enhance the apoptosis, and its mechanism might be related to inducing tumor cell apoptosis through activating caspase-3.

Key words: lung carcinoma; copper (Ⅱ) complex with coumarin derivatives; cell proliferation; apoptosis; caspase-3

铂类抗肿瘤药物是应用最广泛的化疗药物，但易产生耐药性，且对肾脏、肝脏、骨髓及神经系统等具有毒副作用，限制了其在临床上的应用[1～3]。设计和制备新型、高效、低毒的抗肿瘤药物已成为抗肿瘤药物研究的热点。铜是人体中血蓝蛋白的重要组成元素。目前研究显示，许多有机铜配合物具有抗肿瘤活性，在体内外均对肿瘤细胞具有抑制作用[4～7]。香豆素类化合物具有良好的抗肿瘤活性，其抗肿瘤活性的强度与作用时间及剂量呈正相关[6～10]。本课题组前期研究中合成了新型香豆素类酰腙—铜配合物(以下缩写为CCCD)，发现其在体外能抑制肝癌细胞、白血病细胞及前列腺癌细胞的生长，诱导肿瘤细胞凋亡[6]。2015年1～6月，我们观察了CCCD在体内外对肺癌细胞的抑制作用，进一步探讨其抗肿瘤作用机制。

1材料与方法

1.1动物及材料雌性BALB/c裸鼠4周龄18只，体质量12～16 g，购自扬州农学院；肺腺癌A549细胞购自北京协和细胞资源中心；Annexin V/PI检测试剂盒购自美国BD公司；TUNEL试剂盒购自南京凯基生物有限公司；MTT试剂盒购自Sigma公司；Caspase-3抗体购自圣克鲁斯生物技术公司；DMEM细胞培养基及胎牛血清购自Gibco公司。

1.2CCCD对A549细胞的抑制作用观察采用MTT法。将A549细胞以1×105/mL单细胞悬液接种于96孔培养板，每孔100 μL，分为干预组、对照组及调零组。干预组分别加入5、10、20、30、50、80、120、160 μmol/L的CCCD，对照组不加入CCCD，调零组仅加入100 μL的培养基而不加入A549细胞，每组均设立3个平行孔。将各组细胞在37 ℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养72 h，培养结束前4 h每孔加入MTT 20 μL，继续培养4 h后再加入DMSO 100 μL，振荡摇匀。采用全自动酶联免疫检测仪，测定各孔在570 nm波长处的光密度(OD)值，计算细胞生长抑制率(IR)及半抑制浓度(IC50)值。IR=[1-(干预组OD值-调零组OD值)/(对照组OD值-调零组OD值)]×100%。用Origin7.0的非线性拟合对IR曲线进行拟合，将IR为50%时对应的药物浓度定义为IC50。

1.3A549细胞凋亡检测采用AnnexinV/PI流式细胞术。将A549细胞以1×106/mL单细胞悬液接种于96孔培养板，分为干预组及对照组，其中干预组设立3个复孔。待A549细胞覆盖80%板底后，在干预组3个复孔中分别加入10、20、40 μmol/L的CCCD，对照组加入PBS溶液。48 h后去除上清液，PBS洗涤，胰酶消化离心，加入Binding Buffer中，细胞浓度调整为1×106/mL，先后加入Annexin V和PI各5 μL，室温避光作用30 min后，立即上流式细胞仪进行检测，计算细胞凋亡率。

1.4Caspase-3蛋白表达检测采用Western blot法。细胞培养及分组方法同1.3。待A549细胞覆盖80%板底后，干预组加入20 μmol/L CCCD，对照组加入PBS溶液。48 h后去除上清液，PBS洗涤，将A549细胞胰酶消化离心后，用细胞裂解液提取细胞质及细胞核蛋白，对蛋白样品进行Western blot分析，用Gel-Pro软件对条带进行相对灰度值测定。

1.5肺癌荷瘤鼠模型制备及CCCD对肿瘤的抑制作用观察将A549单细胞悬液调整为细胞密度5×106/mL，以0.1 mL/只注射于裸鼠右侧腋窝皮下，待瘤体生长至1～2 cm3时分离出新鲜的鱼肉状肿瘤组织，均匀分割成1 mm3大小组织块，传代接种，建立肺癌荷瘤鼠模型。待荷瘤鼠瘤体体积生长至0.5 cm3左右时，随机分为3组，分别为观察1组、观察2组、对照组，每组各6只。观察1组、观察2组及对照组分别予4、8 mg/kg CCCD及PBS进行尾静脉注射，1次/周，共3周。干预结束后1周测量各组肿瘤短径(a)及长径(b)，计算肿瘤体积(V=a2×b×0.52)及抑瘤率[抑瘤率=(对照组平均肿瘤体积-观察组平均肿瘤体积)/对照组平均肿瘤体积×100%]。随后处死所有裸鼠，取皮下瘤体组织，制成10 μm厚的石蜡切片，应用TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡情况。在400×视野下选择阳性细胞分布均匀的区域，连续计数100个细胞，并计数其中荧光标记的阳性细胞，重复3次，在显微镜下观察计数各组移植瘤的凋亡指数(AD)。AD=凋亡细胞数/(凋亡细胞数+未凋亡细胞数)×100%。

2结果

2. 1A549细胞生长抑制情况加入5、10、20、30、50、80、120、160 μmol/L CCCD后，A549细胞IR分别为8.80%、16.52%、37.24%、55.75%、77.22%、87.16%、95.25%、98.70%，随着CCCD浓度增高，IR呈增高趋势，见图1。IC50为23.0 μmol/L。

图1　不同浓度CCCD干预后A549细胞IR变化

2.2细胞凋亡情况干预组予10、20、40 μmol/L CCCD及PBS干预后，细胞凋亡率分别为15.63%±6.57%、30.65%±11.43%、51.90%±16.23%及6.24%±2.52%，干预组细胞凋亡率均高于对照组(P均<0.05)。

2.3Caspase-3蛋白表达干预组、对照组的Caspase-3相对灰度值分别为1.18±0.019、0.22±0.024，干预组Caspase-3蛋白表达高于对照组(P<0.05)。

2.4AD及抑瘤率观察1组、观察2组、对照组AD分别为16.83%±8.44%、24.65%±11.24%、3.30%±2.12%，各组间比较P均<0.05。观察1组、观察2组抑瘤率分别为51.08%、56.78%。

3讨论

铜是人体中重要的微量元素，能与蛋白、核酸等生物分子结合发挥生物学活性。金属铜有良好的配位特性，金属铜类配合物可直接作用于脱氧核糖核酸药物，切断DNA链，抑制癌细胞增殖，并诱导癌细胞凋亡。目前研究发现，许多有机铜配合物具有抗肿瘤活性，有些有机金属铜配合物的抗肿瘤活性甚至超过了顺铂[11,12]。

香豆素是一类具有苯骈-δ吡喃内酯环的重要有机杂环化合物，化学结构简单，易进行化学合成和修饰，一些香豆素衍生物能够选择性作用于肿瘤细胞发挥抗肿瘤作用，且在体内的毒性较低。但是天然香豆素存在生物活性低、生物利用度差等缺陷，限制了其临床应用。研究发现，以香豆素为先导化合物进行结构修饰后，可增强香豆素的生物学活性，如香豆素与铜进行结构修饰后，制备出的香豆素类酰腙—铜配合物可具备一定的抗肿瘤活性。香豆素衍生铜配合物发挥抗肿瘤作用主要通过分子水平与蛋白和DNA直接作用，导致分子结构与功能改变，发生裂解与凋亡，或诱导产生氧自由基，间接引起生物分子的降解等[6～8]。本课题组制备的CCCD能在体外很好地结合到小牛胸腺DNA上，能促进肝癌细胞、白血病细胞及前列腺癌细胞的凋亡。本研究发现，干预组加入不同浓度的CCCD后，随着药物浓度增高，IR呈增高趋势，提示CCCD可明显抑制A549细胞的生长，且随着浓度增高，对A549细胞的生长抑制作用逐渐增强；体内实验发现，观察1组、观察2组抑瘤率分别为51.08%、56.78%，提示CCCD在体内也可发挥抑制肿瘤生长的作用，且随着药物浓度增加，抑制肿瘤生长的作用增强。

肿瘤发生的机制之一是细胞在正常凋亡过程中失控，导致细胞不受控制的过度增殖，因此诱导肿瘤细胞凋亡是治疗肿瘤的途径之一。目前临床上应用的许多抗肿瘤药物都具有不同程度的诱导肿瘤细胞凋亡作用[13]，诱导肿瘤细胞凋亡己成为肿瘤治疗的有效策略[14]。本研究发现，干预组不同浓度的CCCD干预后，细胞凋亡率均高于对照组，提示CCCD可明显诱导A549细胞凋亡，并随着药物浓度增加，A549细胞凋亡增多；观察1组、观察2组AD均高于对照组，提示CCCD在体内也具有诱导肺癌细胞凋亡的作用，并随着药物浓度增加，细胞凋亡增多。

细胞凋亡是由众多的凋亡相关蛋白参与的细胞程序性死亡过程。研究发现，Caspase家族蛋白是细胞凋亡的关键执行者，目前已发现14种以上Caspase家族成员，其中Caspase-3是该家族中最重要的成员，是介导细胞凋亡的关键因素[15,16]。本研究发现，干预组Caspase-3蛋白的表达高于对照组，提示CCCD可促进Caspase-3活性增加，可能是CCCD发挥诱导A549细胞发生凋亡的作用机制之一。

综上所述，CCCD在体内外均可抑制肺癌A549细胞的生长，可能与其促进细胞凋亡有关，本研究为CCCD应用于肺癌的治疗提供了依据。

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