微小RNA－21在小鼠肺成纤维细胞炎症反应中的表达变化及意义

微小RNA-21在小鼠肺成纤维细胞炎症反应中的表达变化及意义

赵红，姚平波，戴利，何军，董素素，张平

(南华大学护理学院，湖南衡阳421001)

摘要：目的观察小鼠肺成纤维细胞炎症反应中微小RNA-21(miR-21)及其下游靶基因含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶(ADAMTS-1)的表达变化,并探讨其临床意义。方法体外培养小鼠NIH3T3成纤维细胞，分为对照组和TGF-β1组。TGF-β1组加入终浓度为5 μg/L的TGF-β1，分别作用24、48、72、96、120 h。对照组不加入TGF-β1。收集两组上清液，采用ELISA法测定TNF-α、IL-1β、IL-6水平，应用qRT-PCR技术检测miR-21及ADAMTS-1的表达。结果TGF-β1组24、48、72、96、120 h时TNF-α、IL-1β、IL-6水平及miR-21表达均高于对照组，ADAMTS-1表达均低于对照组(P均<0.05或0.01)。结论 在TGF-β1诱导的大鼠肺成纤维细胞的炎症反应中，miR-21表达增高、ADAMTS-1表达降低；miR-21可成为预防和治疗肺纤维化新的分子靶点。

关键词：转化生长因子β1；微小RNA；炎症；成纤维细胞；肺

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.42.004

中图分类号：R563.9文献标志码：A

基金项目：湖南省自然科学基金资助项目(14JJ7044)；湖南省教育厅高等学校科学研究项目优秀青年项目(14B156)。

作者简介：第一赵红(1978-)，女，讲师，研究方向为呼吸内科疾病的诊断与治疗。E-mail: zhaohong779900@163.com

收稿日期：(2015-08-10)

Expression changes of microRNAs-21 in inflammation reaction of

lung fibroblast cells of mice and the significance

ZHAOHong,YAOPing-bo,DAILi,HEJun,DONGSu-su,ZHANGPing

(SchoolofNursing,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression changes of microRNAs-21 (miR-21) and its downstream target genes (a disintegrin and metalloprotease with thrombospond in type 1 motifs, ADAMTS-1) in inflammation reaction of lung fibroblasts cells of mice and the clinical significance. MethodsThe fibroblast cell line NIH3T3 of mic+9e were cultured in vitro and then were divided into the control group and the TGF-β1 group. The TGF-β1 group was added with 5 μg/L TGF-β1 for stimulating 24, 48, 72, 96 and 120 h. The control group was not treated. The supernatant of the two groups was collected at different time points. Using the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) to detect the levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α), inflammatory cytokine interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-6 (IL-6). The cells were collected at different time points. We used the real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (PCR) to detect the expression of miR-21 and ADAMTS-1. Results The expression levels of TNF-a , IL-1β, IL-6 and miR-21 in the TGF-β1 groups at 24, 48, 72, 96 and 120 h were higher than those of the control group; the expression level of ADAMTS-1 was lower than that of the control group (all P<0.05 or P<0.01). Conclusions In the TGF-β1-induced inflammatory responses of lung fibroblast cells of mice, the miR-21 expression is up-regulated, while the ADAMTS-1 expression is down-regulated; miR-21 may be a new molecular target for the prevention and treatment of pulmonary fibrosis

Key words: transforming growth factor -β1; microRNAs-21; inflammation; fibroblast cells; lung

微小RNA(miRNA)是一类能够在转录后水平调控基因表达的内源性非编码RNA[1]。近年研究发现，miRNA参与了机体免疫及炎症反应的调节，其中miRNA-21(以下简称miR-21)与炎症反应密切相关[2]。但miR-21是否参与肺成纤维细胞的炎症反应尚不明确。2014年1月～2015年6月，我们检测了在转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的小鼠肺成纤维细胞炎症反应中，miR-21及其下游靶基因含Ⅰ型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶(ADAMTS-1)的变化，探讨miR-21在肺纤维化炎症反应中的作用。

1材料与方法

1.1材料小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3购于中国科学院细胞库；DMEM培养基购于美国Sigma-Aldrich公司；胎牛血清购于美国Gibco公司；鼠 TNF-α、IL-1β、IL-6酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒购于Abcam公司；TRIzol购于美国Invitrogen公司；PrimeScript逆转录试剂盒和实时荧光定量试剂盒购于Fermants公司；逆转录实时定量聚合酶链反应(PCR)引物购于美国Invitrogen公司。

1.2细胞培养及干预方法NIH3T3细胞用含10%胎牛血清的DMEM在5%CO2、37 ℃下恒温培养，0.25%胰蛋白酶消化、传代。将细胞均匀接种在3孔板上，待细胞亚融合后改用无血清的DMEM培养液同步化饥饿24 h，分为对照组和TGF-β1组。TGF-β1组在培养基中加入终浓度为5 μg/L的TGF-β1，分别作用24、48、72、96、120 h后收集上清液及细胞备检。对照组不加入TGF-β1。

1.3炎症因子水平检测收集两组上清液，采用ELISA法测定TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。

1.4miR-21及ADAMTS-1表达检测收集两组细胞，应用qRT-PCR技术检测miR-21及ADAMTS-1的表达。应用TRIzol法提取各组细胞总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量，紫外分光光度计测定总RNA浓度及纯度。按miScriptⅡ反转录试剂盒说明，经反转录合成cDNA。总反应体系20 μL，反应条件为孵育37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，使用无酶水稀释后-70 ℃冰箱保存备用。引物由MRC Gene公司设计合成， 配制反应混合物。每个反应体系为10 μL，使用罗氏Light Cycler480荧光定量PCR仪检测，反应条件为95 ℃ 30 s预变性，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s重复40个循环进行扩增反应；95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s制备融解曲线。每个样品设3个复孔。采用标准曲线法计算mRNA和ADAMTS-1表达量，并计算其相对表达量。

2结果

TGF-β1组在24、48、72、96、120 h时TNF-α、IL-1β、IL-6水平及miR-21表达均高于对照组，ADAMTS-1的表达均低于对照组(P均<0.05或0.01)。见表1。

表1　两组不同时间点上清液炎症因子水平及细胞miR-21、ADAMTS-1表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05，﹟P<0.01。

3讨论

肺纤维化疾病的特征为肺间质过多的胶原及细胞外基质沉积，其发病机制尚不完全明确。目前认为，肺纤维化与炎症反应、免疫反应、肺损伤等密切相关[3]。炎症反应在肺纤维化过程中发挥关键作用，可通过TGF-β/Smad信号通路活化核转录因子-κB(NF-κB)，启动炎症反应，诱导促炎因子如TNF-α、IL-β、IL-6大量表达，最终可导致肺纤维化的发生[4]。研究发现，TGF-β1可诱导大鼠肺成纤维细胞TNF-α、IL-β、IL-6表达增高，促进炎症反应的发生[1,5]。本研究发现，TGF-β1组24、48、72、96、120 h时TNF-α、IL-1β、IL-6的表达均高于对照组，提示TGF-β1诱导了大鼠肺成纤维细胞的炎症反应。

miRNAs参与机体内炎症过程的调节，并与肺纤维化有关。郭东等[6]研究发现，miR-21表达增高可减少TNF-α诱导的心肌细胞凋亡，提示过表达miR-21可影响心脏成纤维细胞的增殖与分化。研究表明，多种miRNAs可通过炎症反应参与肺纤维化过程，如miR-155、miR-149等[7～9]。

miR-21是与纤维化疾病密切相关的miRNA，在多种器官纤维化的调控中发挥着重要的作用。刘理静等[9～11]研究发现，miR-21在博莱霉素诱导的纤维化小鼠组织和NIH3T3细胞中均呈高表达，使用miR-21反义探针可以显著减轻博来霉素引起的小鼠肺纤维化，提示miR-21在肺纤维化小鼠肺组织中表达上调，miR-21高表达可促进肺成纤维细胞增殖、转分化以及胶原蛋白的合成。本研究发现，TGF-β1组24、48、72、96、120 h时miR-21的表达均高于对照组，提示TGF-β1可上调成纤维细胞miR-21表达，可能与炎症反应的发生有关。

ADAMTS-1能够抑制胶原蛋白聚集和增加细胞外基质分解，在纤维结缔组织形成及平滑肌增生中起重要作用，还可抑制大鼠过敏性肺炎的纤维化和炎症过程。研究发现，miR-21对肺纤维化的演化及推动作用与TGF-β1/ADAMTS-1信号通路密切相关[12～14]。miR-21可通过调控ADAMTS-1参与小鼠肺纤维化过程[15]。本研究发现，TGF-β1组24、48、72、96、120 h时miR-21表达均增高、ADAMTS-1表达均降低，提示miR-21的上调及ADAMTS-1的下调可能参与了TGF-β1刺激后肺纤维化的发生过程，可能与两者均参与对肺纤维化的调控有关。

综上所述，在TGF-β1诱导的大鼠肺成纤维细胞的炎症反应中，miR-21表达增高，miR-21有望成为预防和治疗肺纤维化的新的分子靶点。然而，miR-21对炎症因子表达的影响及其调控机制尚需进一步实验研究。

参考文献：

[1] Gao Y, Lu J, Zhang Y, et al. Baicalein attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats through inhibition of miR-21[J]. Pulm Pharmacol Ther, 2013,26(6):649-654.

[2] Honeyman L, Bazett M, Tomko TG,et al. MicroRNA profiling implicates the insulin-like growth factor pathway in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice[J]. Fibrogenesis Tissue Repair, 2013,6(1):1-10.

[3] 赵红,张平,贺兼斌.硫化氢对肺成纤维大PD-1表达的影响[J].中国急救医学杂志,2014,34(3):1140-1143.

[4] 刘理静,张平,赵红.白藜芦醇通过ADAMTS-1/ TGF-β1信号通路抑制肺纤维化[J].中国药理学通报,2013,29(3):425-431.

[5] 王莎莎,范晶晶,倪春辉. 肺纤维化与microRNA研究进展[J].中华劳动卫生职业病杂志,2013,31(5):398-400.

[6] 郭东,张闽红,肖清萍,等. microRNA-21通过促进成纤维细胞的增殖和分化调节心肌梗死后的心脏重塑[J].天津医药,2014,42(5):447-450.

[7] Hu R, Huffaker TB, Kagele DA, et al. MicroRNA-155 confers encephalogenic potential to Th17 cells by promoting effector gene expression[J]. J Immunol, 2013,190(12):5972-5980.

[8] 范晶晶，吉晓明，王莎,等. 二氧化硅诱导的肺纤维化中rniR-149对白细胞介素-6的调节[J]. 中华劳动卫生职业病杂志,2014,32(3):161-167．

[9] 刘理静,钱红,赵红,等. 上调miR-21表达促进肺成纤维细胞增殖和胶原蛋白合成[J].细胞与分子免疫学杂志,2015,31(7):918-922．

[10] 刘理静,钱红,赵红,等. 白藜芦醇对人胚肺成纤维细胞株MRC-5生长的抑制作用[J].中国药理学通报,2015,31(5):673-678.

[11] 刘理静,钱红,张平,等. 大黄素对肺纤维化大鼠的保护作用及部分机制研究[J]. 中国药理学通报,2015,31(2):266-272.

[12] Zhou X, Li YJ, Gao SY, et al. Sulindac has strong antifibrotic effects by Suppressing STAT3-related miR-21[J]. J Cell Mol Med, 2015,19(5):1103-1113.

[13] Ji X, Wu B, Fan J, et al. The anti-fibrotic effects and mechanisms of microRNA-486-5p in pulmonary fibrosis [J]. Sci Rep, 2015,15(5):14131.

[14] Qi W, Li H, Cai XH, et al. Lipoxin A4 activates alveolar epithelial sodium channel gamma via the microRNA-21/PTEN/AKT pathway in lipopolysaccharide-induced inflammatory lung injury[J]. Lab Invest, 2015,25(16):724-732.

[15] 赵红,姚平波,戴利,等. miR-21对ADAMTS-1的调节在肺纤维化体内外实验中的研究[J]. 实用医学杂志,2015,31(15):2426-2429.