水飞蓟宾抑制NF-κB活化下调H2O2诱导心肌细胞iNOS表达的实验研究

水飞蓟宾抑制NF-κB活化下调H2O2诱导心肌细胞iNOS表达的实验研究*

武艳强王慧娟冯社军袁芳李鹤飞冯强侯爱军申玉良

(邯郸市中心医院， 河北 邯郸 056001)

【摘要】目的探讨水飞蓟宾(SIL)对H2O2诱导状态下H9C2心肌细胞iNOS的调节作用及其相关的分子机制。方法将大鼠心肌H9C2细胞分为对照组(Control组)、水飞蓟宾+H2O2组 (SIL+H2O2组)和H2O2组三组。在200μM的H2O2干预6小时后使用RT-PCR法和western blot法对H9C2心肌细胞iNOS mRNA和蛋白的表达水平进行检测，使用western blot法对H9C2心肌细胞NF-κB磷酸化水平(Phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65比值)进行测量。结果与对照组相比较，在H2O2干预6小时后 H9C2心肌细胞iNOS mRNA和蛋白的表达水平和NF-κB p65活化水平均明显增高，差异均有统计学意义(P均<0.05)；但与H2O2组相比较水飞蓟宾+H2O2组iNOS mRNA和蛋白的表达及NF-κB p65磷酸化水平的增加更加显著，差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论在过氧化氢诱导的H9C2心肌细胞氧化应激和损伤过程中水飞蓟宾可能可以通过抑制NF-κB p65的活化下调iNOS的表达，对心肌细胞有保护作用。

【关键词】水飞蓟宾； H9C2心肌细胞； 过氧化氢(H2O2)； 诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)； NF-κB

【中图分类号】R 965.2【文献标志码】A

基金项目：河北省卫生厅重点科技研究计划(20130359)

收稿日期：( 2014-08-07； 编辑： 张文秀)

Down-regulates iNOS expression of silibinin by inactivation of NF-κB in H2O2-induced H9C2 cardiomyocytes WU Yangqiang, WANG Huijuan，FENG Shejun，etal

(HandanCentralHospital,Handan056001,Hebei,China)

Abstract【】ObjectiveTo investigate the role of silibinin (SIL) on the regulation of iNOS expression in H2O2-induced injury, and its potential mechanism in rat H9C2 cardiomyocytes. MethodsH9C2 cardiomyocytes were divided into three groups, Control group, SIL+H2O2 group and H2O2 group. After 6 hours H2O2 stimulation, RT-PCR was used to measure the mRNA expression of iNOS. Meanwhile, western blot was performed to analyze the protein expression of iNOS and the ratio of phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65. ResultsAfter 6 hours H2O2 stimulation, the mRNA and protein expression of iNOS was significantly enhanced, and the ratio of phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65 was largely increased. Moreover, H2O2-induced the up-regulation of iNOS and the enhanced level of NF-κB p65 were both inhibited by silibinin in rat H9C2 cardiomyocytes. ConclusionsSilibinin down-regulates iNOS expression possibly via inactivation of NF-κB p65 in H9C2 cardiomyocytes after H2O2 stimulation.

【Key words】Silibinin; H9C2 cardiomyocytes; H2O2; iNOS; NF-κB

水飞蓟宾(silibinin, SIL)属于水飞蓟素(silymarin)的一种，是药用菊科植物水飞蓟主要的活性成分之一[1-3]。目前药理研究证实水飞蓟宾具有抑制炎症反应、抑制氧化应激、抗纤维化、促进细胞再生和促进脂代谢等较为广泛的生物活性和药理价值[1-5]。目前临床上广泛应用于肝硬化、肝炎及中毒等疾病的治疗[1-5]。进一步的研究显示水飞蓟宾的药理作用和生物活性与调节核转录因子-κB (NF-κB)的活化水平密切相关[6, 7]。本研究的目的是探讨水飞蓟宾对H2O2诱导状态下H9C2心肌细胞iNOS的调节作用，及其相关的分子机制。

1材料和方法

1.1主要试剂和材料大鼠H9C2心肌细胞株购自中国科学院上海细胞库；水飞蓟宾购买于美国Sigma公司；总RNA抽提试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；第一链cDNA合成试剂盒和PCR试剂盒购自日本Takara公司；兔抗鼠iNOS抗体、兔抗鼠phospho-NF-κB p65抗体、兔抗鼠NF-κB p65和兔抗鼠β-actin抗体购于美国Santa Cruz公司。DMEM培养基(美国Gibco公司)，小牛血清(杭州四季清)，甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯，美国Tedia公司)，DMSO (二甲基亚砜，国药集团化学试剂有限公司)，其余试剂均为分析纯。

1.2细胞培养大鼠H9C2心肌细胞常规接种在含15%胎牛血清，100 g/L青霉素、100 g/L链霉素的DMEM/F12培养液中，置于37℃，5 % CO2，孵箱内培养。每72h换液、传代1次，取对数生长期细胞用于实验。H9C2心肌细胞分为对照组(Control组)、水飞蓟宾+H2O2组 (SIL+H2O2组)和H2O2组，共3组。其中对照组细胞加入PBS；H2O2组和水飞蓟宾+H2O2组加入H2O2(200μM)；水飞蓟宾+H2O2组加入100μM的水飞蓟宾进行干预。

1.3细胞iNOS mRNA表达检测干预6h后，按照RT-PCR试剂盒说明书提取细胞总RNA。引物：iNOS正义5′-TCTGTGCCTTTGCTGATGAC-3′，反义5′-CATGGTGAACACGTTCTTGG -3′和β-actin正义：5′- ACCCCGTGCTGCTGACCGAG-3′，反义：5′-GCCGCTGGGGAAGATGTGCT-3′。按照试剂盒说明书介绍进行反转录和扩增实验。应用凝胶成像系统(Bio-rad)摄影，Quantity One软件对目的条带进行扫描分析。用与β-actin PCR产物条带灰度比值作为iNOS mRNA的相对表达量。

1.4Western blot法检测细胞中iNOS蛋白表达和NF-κB活化水平干预6h后，按照试剂盒操作要求，首先提取细胞总蛋白，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转移至硝酸纤维素滤膜上，用脱脂奶粉封闭1h，分别加入兔抗鼠iNOS抗体 (1∶800)、兔抗鼠phospho-NF-κB p65抗体(1∶1000)、兔抗鼠NF-κB p65抗体(1∶1000)和兔抗鼠β-actin 抗体(1∶1500)，4 °C孵育过夜，洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2000)，用ECL进行显色，用凝胶成像分析系统进行扫描。使用iNOS/β-actin和Phospho- NF-κB p65/total NF-κB p65显影强度比值进行蛋白表达量分析。

1.5统计学方法计量资料以均数±标准差表示。采用SPSS 17.0进行单因素方差分析，两样本均数多重比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1iNOS mRNA和蛋白的表达在干预6h后，使用RT-PCR法和western blot法对H9C2心肌细胞iNOS mRNA和蛋白的表达进行检测。发现与对照组相比较，H9C2心肌细胞在H2O2刺激后iNOS mRNA和蛋白的表达水平显著增加，差异均有统计学意义(P均<0.05)。但与H2O2组相比较，水飞蓟宾+H2O2组iNOS的表达增加水平更加显著，差异均有统计学意义(P均<0.05)，见图1和表1。

图1H9C2心肌细胞iNOS表达的RT-PCR和western blot结果

Figure 1The RT-PCR and western blot results of iNOS in H9C2 cardiomyocytes

Table 1The mRNA and protein expression of iNOS, and the phosphorylation level of NF-κB p65 in H9C2 cardiomyocytes

组别iNOSmRNAiNOS蛋白Phospho-NF-κBp65/totalNF-κBp65Control组0.21±0.050.19±0.040.22±0.05H2O2组0.92±0.09①0.94±0.11①0.97±0.05①水飞蓟宾+H2O2组0.51±0.17①②0.46±0.14①②0.53±0.12①②

注：①与Control组相比较P<0.05；②与H2O2组相比较P<0.05

2.2NF-κB p65的活化水平在H2O2干预6h后，使用western blot法对H9C2心肌细胞NF-κB p65磷酸化水平(Phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65比值)进行检测。结果发现与Control组相比较，H9C2心肌细胞在H2O2干预后Phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65比值明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。但与H2O2组相比较，水飞蓟宾+H2O2组Phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65比值增加水平更加明显，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2和表1。

图2H9C2心肌细胞NF-κB p65活化的western blot结果

Figure 2The western blot results of the phosphorylation of NF-κB p65 in H9C2 cardiomyocytes

3讨论

冠状动脉硬化性心脏病(coronary arteriosclerotic heart disease, CAD)简称冠心病。是由血脂血糖异常增高等多种因素导致的冠状动脉血管内皮细胞持续的慢性损伤，致血小板和泡沫细胞聚集，脂质斑块形成，最终导致血管腔部分或完全阻塞而引起血供相应区域心肌细胞缺血缺氧坏死的临床综合征[8-11]。血流变学调查结果显示冠心病业已成为导致人类死亡的头号疾病[8-11]。心肌保护(cardiomyocytes protection)即通过减轻和抑制心肌炎症反应和氧化应激减少心肌细胞的死亡和凋亡，在冠心病尤其是急性冠状动脉综合征(acute coronary syndromes, ACS)是CAD治疗中扮演着重要的角色[8-11]。

研究表明ACS导致过度的炎症反应和氧化应激是诱导心肌细胞坏死和凋亡的重要原因，抑制并减轻炎症反应和氧化应激可以有效减缓心肌细胞的死亡及损失的范围[8-12]。水飞蓟素(silymarin)是中药菊科植物水飞蓟的有效活性成分，包括水飞蓟宾(silibinin)、异水飞蓟宾(isosilybin)、水飞蓟宁(silydianin)和水飞蓟亭(silychristin)等多种化合物的总称[1-7]。研究发现水飞蓟宾的药理作用最显著，具有抑制炎症反应、抑制氧化应激、促进糖代谢和脂代谢、抑制器官纤维化和调节细胞凋亡等的作用。水飞蓟宾还具有抑制肿瘤增殖、转移和肿瘤血管生成等生物活性[1-7]。在炎症状态下，水飞蓟宾可以有效的抑制LPS诱导的人HMC-1肥大细胞组胺的释放，以及炎症介质TNF-α、IL-6和IL-8的合成[13]。水飞蓟宾紫外线诱导的小鼠成纤维L929细胞凋亡和自噬具有保护作用[14]，可以有效抑制卵清蛋白(OVA)诱导的小鼠气道炎症[15]。诱导性一氧化氮合酶(iNOS)在氧化应激反应中扮演着重要的角色，在氧化应激过程中iNOS表达上调，使NO合成增加[16, 17]。NO具有多种生物活性，低剂量即生理状态下时可作为第一信号分子，调节血管内皮细胞舒张；但在炎症状态和氧化应激状态下NO作为强氧化剂可以直接损伤心肌细胞和血管内皮细胞，诱导细胞的凋亡和坏死[16, 17]。

近期的研究表明水飞蓟宾的抑制炎症和氧化应激反应的药理作用与抑制调节核转录因子-κB (NF-κB)的活化水平密切相关[13, 15, 18]。NF-κB作为重要的且广泛表达的核转录因子，在多种生理和病理状态下扮演着重要的角色[19, 20]。NF-κB活化后形成二聚体，经细胞核膜表明的核孔转位进入细胞核内，与下游基因转录调控区的κB序列结合，调控该基因的转录活性[19, 20]。大量研究显示抑制NF-κB的活化对于减轻炎症反应和氧化应激反应有关键作用[19, 20]。Tao Zhu等人的研究发现穿心莲内酯可以通过抑制NF-κB活化减轻LPS诱导小鼠肺组织的炎症反应[20]。NF-κB对iNOS的转录和表达具有关键调控作用[21]。本实验结果表明水飞蓟宾对H2O2诱导的心肌H9C2细胞NF-κB活化有显著的抑制作用。

4结论

在过氧化氢诱导的H9C2心肌细胞氧化应激、炎症反应和损伤过程中水飞蓟宾可能可以通过抑制NF-κB p65的活化下调iNOS的表达，对心肌细胞有保护作用。

【参考文献】

[1]王红军, 姜嫒媛, 路平, 等. 水飞蓟宾的抗肿瘤、抗氧化和免疫调节分子药理学机制研究进展[J]. 药学学报, 2010(4): 413-421.

[2]孙立霞, 马健飞, 樊怡, 等. 水飞蓟宾对高糖作用下大鼠腹膜间皮细胞整合素连接激酶、转化生长因子β1及α平滑肌肌动蛋白表达的影响[J]. 中华肾脏病杂志, 2013; 29(04): 268-272.

[3]潘珺, 黄智敏, 赵秀芬, 等. 水飞蓟宾对高糖诱导人足细胞中VEGF表达的影响[J]. 江苏医药, 2010; 36(10): 1124-1127.

[4]Wang Y, Liang WC, Pan WL,etal. Silibinin, a novel chemokine receptor type 4 antagonist, inhibits chemokine ligand 12-induced migration in breast cancer cells [J]. Phytomedicine, 2014, 21(11):1310-1317.

[5]Wang YX, Cai H, Jiang G,etal. Silibinin Inhibits Proliferation, Induces Apoptosis and Causes Cell Cycle Arrest in Human Gastric Cancer MGC803 Cells Via STAT3 Pathway Inhibition [J]. Asian Pac J Cancer Prev. 2014, 15(16): 6791-6798.

[6]Chen YH, Chen CL, Liang CM,etal. Silibinin inhibits ICAM-1 expression via regulation of N-linked and O-linked glycosylation in ARPE-19 cells [J]. Biomed Res Int. 2014,(7):01395.

[7]Yousefi M, Ghaffari SH, Zekri A,etal. Silibinin induces apoptosis and inhibits proliferation of estrogen receptor (ER)-negative breast carcinoma cells through suppression of nuclear factor kappa B activation [J]. Arch Iran Med. 2014, 17(5):366-371.

[8]樊秀红, 牟娜, 王玉龙. 丹参多酚酸盐治疗冠心病心绞痛的疗效与安全性评价[J]. 西部医学, 2014, 26(3): 328-330.

[9]廖永红, 郭依桂, 金玮. 血清 ALT 水平对冠心病患者病情的预测价值研究[J]. 西部医学, 2014, 26(3): 288-290.

[10] 吴龙川, 蔡鑫, 邵杉, 等. 冠心病患者血清sCD40L和MMP-9水平变化及其相关性研究[J]. 西部医学, 2009; 21(07): 1105-1107.

[11] 周琳, 饶莉. 过氧化物酶体增殖物激活受体-γ与冠心病炎性过程[J]. 西部医学, 2008; 20(01): 188-190.

[12] 易全会, 程亚玲. 急性冠脉综合症患者血清胆红素尿酸及纤维蛋白原变化的临床意义[J]. 西部医学, 2013; 25(01): 96-97, 99.

[13] Kim BR, Seo HS, Ku JM,etal. Silibinin inhibits the production of pro-inflammatory cytokines through inhibition of NF-κB signaling pathway in HMC-1 human mast cells [J]. Inflamm Res. 2013, 62(11): 941-950.

[14] Liu W, Otkur W, Zhang Y,etal. Silibinin protects murine

[3]张守亮，杨峰，祁卫东. 国产吻合器痔上黏膜环切术治疗81例重度痔临床分析[J].安徽医药，2011,15(1)：48-49.

[4]韩小勇，张淑伶，谢振年，等. PPH结合外痔切除术治疗环状混合痔的临床疗效观察[J].河北医学，2013,19(12)：1812-1814.

[5]苏汝康，贠宏伟. 预防吻合器痔上黏膜环切术吻合口并发症70例临床体会[J].中国药物与临床，2014,14(1)：110-111.

[6]Oh SJ，Hong JJ，Oh CA，etal． Stapling technique for performing Billroth Ⅱ anastomosis after distal gastrectomy[J]. J Gast Surg，2011，15(7)：1244-1246.

[7]Lee JY，Woo JH，Choi HJ，etal．Early experience of the compression anastomosis ring (CARTM 27) in left-sided colon resection[J]．World J Gastroenterol，2011，17(43)：4787-4792.

[8]胡丰良，陈丹．无张力钉合在痔上黏膜环切术中的应用[J].广东医学，2012，5(10)：1462-1463.

[9]陈丹，黄丹丹，胡丰良，等．维持压榨技术在直肠癌肠吻合术中的应用[J].实用医学杂志，2014，30(6)：947-949.

[10] 林宏城，任东林，谢尚奎，等．选择性痔上黏膜切除钉合术与痔上黏膜环切钉合术的对比研究[J].广东医学，2011，32(11)：1457-1460.