维吾尔族、汉族胆固醇结石与ApoB基因多态性的研究

维吾尔族、汉族胆固醇结石与ApoB基因多态性的研究

陈敏1,2， 张涛3， 克力木·阿不都热依木4， 张成4， 阿丽叶古丽·艾皮热4

(1,2新疆医科大学, 乌鲁木齐830011, 新疆维吾尔自治区人民医院2肛肠外科，3重症医学一科，4微创疝腹壁外科， 乌鲁木齐830001)

摘要：目的探讨胆固醇结石与ApoB基因多态性之间的关系，以及是否存在维吾尔族(维族)与汉族间的差异。方法采用前瞻性病例-对照研究方法，选择2010年3月-2013年8月在新疆维吾尔自治区人民医院接受手术治疗并经手术证实为胆固醇结石患者189例(胆结石组)，其中维族99例，汉族90例。对照组为年龄和性别与胆结石组相匹配的同期在我院体检中心接受健康体检者，其中维族93例，汉族97例。采用SNaPshot SNP分型技术进行ApoB基因分型，分析两组ApoB基因rs520354、rs1367117位点基因型及等位基因分布频率及其维、汉族间的差异。结果(1)胆结石组中，汉族ApoB基因rs520354位点少见基因型AA频率明显高于维吾尔族，差异有统计学意义(χ2=11.028，P<0.05);而对照组中GG、GA、AA基因型频率未见维、汉族间差异(χ2=1.799，P>0.05)；两组rs520354等位基因分布频率均未见维、汉族间差异。两组rs1367117位点基因型和等位基因分布频率均未见维、汉族间差异(P>0.05)。(2)汉族胆结石组ApoB基因rs520354少见基因型AA频率明显高于对照组，差异有统计学意义(χ2=6.460，P<0.05);而维吾尔族中，rs520354基因型频率未见两组间差异(P>0.05)；维、汉族rs520354等位基因分布频率均未见两组间的差异；维族和汉族rs1367117位点基因型和等位基因分布频率均未见两组间差异(P>0.05)。结论胆结石患者ApoB基因rs520354多态性存在维汉民族间差异，ApoB基因rs520354多态性可能和汉族胆固醇结石相关。ApoB基因rs1367117多态性可能和胆固醇结石无关，且未见维汉民族间差异。但需要进一步增加样本含量及多中心研究来进一步证实。

关键词：ApoB； 胆固醇结石； 基因多态性

中图分类号：R656文献标识码：A

doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.04.010

[收稿日期：2014-09-15]

基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金(2012211A038)

作者简介：张红(1973-)，女，硕士，副主任药师，研究方向：临床药学。

基金项目：新疆维吾尔自治区高校科研计划项目(XJEDU2011I37)

作者简介：黄玫(1979-)，女，硕士，主治医师，研究方向：甲状腺疾病。

ApoB gene polymorphisms in cholesterol gallstone disease in Uygur and Han patients

CHEN Min1,2， ZHANG Tao3, Kelimu Abudureyimu4， ZHANG Cheng4, Aliyeguli Apire4

(1XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China；2DepartmentofAnorectalSurgery,

3DepartmentofFirstIntensiveCareUnit,4DepartmentofMinimallyInvasive,Herniaand

AbdominalSurgery,XinjiangUygurAutonomousRegionPeople′sHospital,Urumqi830001,China)

Abjective: ObjectiveTo explore ApoB gene polymorphisms in cholesterol gallstone disease in Uygur and Han patients. Methods: A prospective case-control study was conducted on Cholesterol gallstone group (189 patients with cholesterol gallstone operation, including 99 Uygur and 90 Han) and control group (190 cases, including 93 Uygur and 97 Han, in good condition, age-and-sex-matched volunteers with physical examination in Medical Centre) in 2012.3-2013.8 from People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region. SNaPshot SNP was adopted to analyze if the distribution of ApoB rs520354 and rs1367117 gene types in the samples of both gallstone group and control group was different between Uygur and Han. Results(1) In gallstone group the infrequent genotype AA frequencies of ApoB gene rs520354 was significantly higher in Hans than that in Uygurs (χ2=11.028， P<0.05), while there was no difference between the two races in controls group (χ2=1.799， P>0.05). ApoBrs520354 gene allele frequencies was not found significantly different between Uygurs and Hans in gallstone group and control group. No significant difference of ApoBgene rs1367117 genotype and allele frequencies was found between Uygurs and Hans in gallstone group or control group. (2) In Hans the infrequent genotype AA frequencies of ApoB gene rs520354 was significantly higher in gallstone group than that in control group (χ2=6.460, P<0.05), while there was no difference between the two races in Uygur (P>0.05). No significant difference of ApoB gene rs1367117 genotype and allele frequencies was found between gallstone group and control in Uygurs or Hans. ConclusionsIt was found out that ApoBrs520354 gene polymorphism was different in Uygur and Han patients with gallstone disease, which indicated some association with gallstone disease Han patients. This study implied that there might be no association of ApoBrs1367117 gene polymorphism with gallstone disease and there was no difference in the race of Uygur and Han. More samples and multi-centered-studies are needed to confirm the findings.

Key words: ApoB; Cholesterol gallstones; gene polymorphism

虽然目前胆结石的确切病因尚不明确，但已经证实胆结石是包括基因和环境等多因素所导致的疾病[1-2]，基因因素在胆石形成中起到了重要作用[3-6]。然而，导致胆结石的常见的致石基因却并未明确。据最近的一项Meta分析表明，目前研究热点集中在 XbaI、EcorI、ID位点的多态性[7]。但这几个位点并非ApoB基因的标签SNPs(Tagging SNPs)，故其研究结果的代表性较为局限。为了获取更具有代表性的位点，本研究通过NCBI最新的数据库，结合标签SNP及相关文献[8]，确定了与胆结石关系密切的标签SNPs:rs520354、rs1367117作为研究对象。采取前瞻性病例-对照研究方法，分析ApoB基因多态性是否存在维吾尔族(维族)与汉族间差异，进而探讨ApoB基因多态性与胆结石的相关性。

1资料与方法

1.1临床资料选择2010年3月-2013年8月在新疆维吾尔自治区人民医院住院并经手术证实为胆囊胆固醇结石的患者189例为胆结石组，其中维族99例，平均年龄(51.55±8.92)岁，汉族90例,平均年龄(52.14±11.08)岁；选择年龄和性别与胆结石组相匹配的同期在我院体检中心接受健康体检者190例为对照组，其中维族93例，平均年龄(50.16±9.32)岁，汉族97例,平均年龄(51.73±8.55)岁。所有入选对象均为在新疆生活超过20 a的维吾尔族及汉族人群。两组人口学资料(年龄、性别、BMI、血脂水平)见表1。

表1　两组研究对象的一般资料( ±s)

1.2主要试剂与仪器琼脂糖(上海生工生物工程技术服务有限公司，AB0013-250g)，Marker DL2000(Takara，3427A)，6×Loading buffer (Takara，9156)，基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司，DP319-02)。凝胶成像系统(美国BIORAD GelDoc XR)，水平电泳仪及电源(北京六一仪器厂DYCP-31DN及DYY-6C型)，台式高速冷冻离心机(上海力新公司，Neofuge 15R)，核酸蛋白定量仪(K5500，北京凯奥科技发展有限公司)。

1.3方法

1.3.1血液样本采集胆结石组患者及对照组空腹12 h以上，采血时分别用EDTA 抗凝真空采血管和普通生化采血管，采集外周静脉血各5 mL，抗凝血冻存于-80℃保存，待提取DNA备用。非抗凝血用于生化检测。

1.3.2血液生化指标的检测所有血脂指标由新疆维吾尔自治区人民医院医学检验中心统一测定。采用甘油磷酸氧化酶法测定甘油三酯(TG)，采用氧化酶法测定胆固醇(TC)，采用清除法测定高密度脂蛋白(HDL)，采用选择性溶解法测定低密度脂蛋白(LDL)。

1.3.3基因组DNA提取采用基因组提取试剂盒提取两组血中的DNA。

1.3.4SNP标签的选择及引物的设计通过NCBI最新的数据库，登陆人类HapMap计划数据库，参照Ⅱ期及Ⅲ期数据库，利用Haploview4.2软件查找标签SNP，获得ApoB基因的脂代谢紊乱人群中分布的标签SNP(Tagging SNP)：rs520354、rs1367117，并设计PCR引物，用于扩增目的片段,设计SNP位点的延伸引物(表2)用于单碱基延伸。引物用在线Primer3 软件设(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)。

表2　ApoB基因rs520354、rs1367117引物序列

1.3.5基因型分析PCR产物用Qiagen公司的HotStarTaq进行多重PCR获得，其体系为10×Buffer (15 mM Mg2+) 2.0 μL，多重PCR引物(1 μM) 2.0 μL，dNTP(10 mM) 0.6 μL，HotStar (5 U/μL) 0.2 μL，DNA 1.0 μL，Mg2+(25 mM) 1.2 μL，加水不足体系至20 μL。程序为：95℃ 2 min;(94℃ 20 s, 65℃ 40 s) 每个循环下降0.5℃ ,72℃1.5 min,11个循环;94℃ 20 s,59℃ 30 s,72℃1.5 min, 24个循环;72℃ 2 min ，4℃持续。在15 μL PCR产物中加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease I酶，37℃温浴1 h, 75℃灭活15 min。纯化后用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit进行延伸反应。延伸产物用虾碱酶(SAP)纯化后在ABI3730xl上样。SNP分型用GeneMapper4.1(Appliedbiosystems)来分析。

1.4统计学处理采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析。两组等位基因频率及基因型频率的差异用χ2检验。两组年龄、BMI、TG、TC、HDL、LDL指标对比采用t检验，性别分布对比采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1维吾尔族、汉族ApoB基因rs520354位点基因型及等位基因频率的分布胆结石组中，汉族ApoB基因rs520354位点少见基因型AA频率明显高于维吾尔族，差异有统计学意义(χ2=11.028，P<0.05);而在对照组中，GG、GA、AA 3种基因型分布频率未见维、汉族差异(χ2=1.799，P>0.05)；两组等位基因型频率均无维、汉族差异(χ2=0.227，P>0.05；χ2=0.014，P>0.05)，见表3。

表3　维吾尔族、汉族ApoB基因rs520354位点基因型及等位基因的分布/例

2.2维吾尔族、汉族ApoB基因rs1367117位点基因型及等位基因频率的分布胆结石组中GG、GA、AA基因型分布频率在维吾尔族和汉族间未见明显差异(χ2=2.234，P>0.05);在对照组中，GG、GA、AA基因型分布频率亦未见维、汉族差异(χ2=3.902，P>0.05)；且两组等位基因频率均无维、汉族差异(χ2=0.001，P>0.05；χ2=0.444，P>0.05)，见表4。

2.3胆石组和对照组ApoB基因rs520354位点基因型及等位基因频率的分布在维吾尔族中，胆结石组和对照组GG、GA、AA基因型分布频率无差异(χ2=5.386，P>0.05)，两组等位基因频率也无差异(χ2=0.459，P>0.05)；汉族胆结石组ApoB基因rs520354少见基因型AA频率明显高于对照组，差异有统计学意义(χ2=6.460，P<0.05)，见表5。

2.4胆石组和对照组ApoB基因rs1367117位点基因型及等位基因频率的分布在维吾尔族中，胆结石组和对照组GG、GA、AA基因型分布频率无明显差异(χ2=1.276，P>0.05)，两组等位基因频率也无差异(χ2=0.940，P>0.05);在汉族中，胆结石组和对照组GG、GA、AA基因型分布频率亦未见差异(χ2=0.107，P>0.05)，且两组等位基因频率也无差异(χ2=0.112，P>0.05)，见表6。

表4　维吾尔族、汉族ApoB基因rs1367117位点基因型及等位基因的分布/例

表5　胆结石组和对照组ApoB基因rs520354位点基因型及等位基因频率的分布/例

表6　胆结石组和对照组ApoB基因rs1367117位点基因型及等位基因频率的分布/例

3讨论

胆结石作为多因素导致的疾病，其发病主要受基因和环境等因素的影响[9-11]。研究显示胆结石的发病在不同种族间存在统计学差异[12-15]。新疆是多民族聚居的区域，胆结石高发，据流行病学调查显示，新疆胆结石患病率为11.1%～15.5%，明显高于全国水平[16-17]，且维吾尔族胆结石的患病率明显高于汉族[18-20]。本研究以在新疆生活超过20 a的维、汉族胆结石患者作为研究对象，借此减小生存环境的影响，进而分析基因因素在维、汉族胆结石发病中的作用，以期发现导致维吾尔族患病率高的基因风险因素。

根据化学成分的分类，胆结石可以分为胆固醇性胆结石、胆色素性胆结石、混合性胆结石三大类[21]。其中胆固醇性胆结石大多发生在胆囊内，由于其发生与代谢密切相关，故亦称之为“代谢性结石”。为了便于进一步研究基因多态性与血脂代谢及胆结石的相关性，本研究选择了与代谢最为相关的胆固醇结石患者作为研究对象。ApoB基因的标签SNPs中，目前的研究热点为rs520354，因此本研究选取该位点进行研究，便于和既往文献进行参照。同时选取非热点标签SNPs rs1367117进行研究，力求使研究结果更加全面且具有代表性。

3.1ApoB基因型与血脂本研究显示维吾尔族胆结石组的HDL明显增高。结合ApoB基因rs520354位点基因型分析，维吾尔族胆结石组AA型的分布频率明显低于汉族。究其原因，可能为维吾尔族胆结石组中风险基因型AA分布频率降低，进而导致HDL增高，使得胆固醇结石的患病风险低于汉族。与Andreotti等[8]针对汉族人群的研究结果一致，即ApoBrs520354位点A等位基因携带者的胆结石患病风险是不携带者的2倍，可见携带A等位基因将增加胆结石的患病风险。汉族胆结石组患者的TC、TG明显高于对照组，而维吾尔族胆结石组与对照组患者TC、TG无明显差异。结合基因型分析结果，汉族胆结石组的AA型明显高于对照组，推测AA型分布频率增高可能导致TG、TC增高，进而导致汉族胆结石的形成。

3.2ApoB基因型与胆结石ApoB是脂代谢中的主要蛋白质，对低密度脂蛋白(LDL)在血浆中的内稳态起着重要作用。ApoB基因多态性与脂代谢紊乱的发病密切相关[22]。近年来，有关研究表明，ApoB基因多态性与胆石疾病相关[23-24]。ApoB-Xba I多态性被发现与血脂增高相关，且ApoB基因多态性可能为胆结石的易患因素[25]。Stender等[26]研究表明：ApoBrs693CT+TT型比CC型OR值为1.25(0.95～1.63)，提示CC型可能为胆结石的风险基因型。Andreotti等[8]研究也证实：ApoBrs520354多态性与胆管癌及胆结石的发病相关。因此，本研究也选取了ApoB基因rs520354位点作为研究位点，进一步了解其与胆结石的相关性及在不同民族人群中的差异性。本研究选取同在新疆生活超过20 a的维、汉族患者作为研究对象，结果表明：胆结石组中ApoB基因rs520354位点GG、GA、AA基因型分布在维吾尔族和汉族间存在差异且具有统计学意义，而在对照组中，GG、GA、AA基因型未见维、汉族差异，且等位基因频率在胆囊结石组和对照组间也均不存在维、汉族差异。相关研究结果显示：携带ApoB基因rs520354位点AA纯合子者的胆结石患病风险是不携带者的1.6倍[8]。本病例-对照研究发现维吾尔族胆结石组和对照组GG、GA、AA基因型分布无差异，两组等位基因频率也无差异。但汉族胆结石组和对照组的GG、GA、AA差异有统计学意义，在汉族胆结石患者中少见基因型AA的分布频率明显高于对照组，提示AA型基因可能为汉族胆结石的风险基因型，与上述相关研究结果相一致。本研究还发现，同为ApoB基因的标签SNPs，rs1367117位点并未表现出与胆结石的相关性，也未表现出维、汉族间的差异。可见研究位点不同，基因多态性与疾病相关性的研究结果也不尽相同。因此，在今后的研究中，将进一步就ApoB基因的所有SNPs进行综合分析并构建相应的单倍体，方可更加全面地了解ApoB基因与胆固醇结石的相关性。本研究亦证明了ApoB基因多态性存在种族差异，且可能为介导胆结石发病的相关因素，但还需进一步大样本研究来证实。

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(本文编辑杨晨晨)

通信作者：樊勇，女，主任医师,副教授,硕士生导师，研究方向：甲状腺疾病，E-mail:nfmfy@163.com。