多菌种发酵豆粕的筛选试验

■宋春阳 李少宁 聂昌林

（青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109）

豆粕是饲料工业中应用最为广泛的植物性蛋白原料，但其中存在的多种抗营养因子，降低了动物对豆粕营养物质的吸收和利用。目前，消除大豆粕中抗营养因子的主要方法有物理加热法、化学处理法和微生物处理法[1]。用微生物发酵法处理豆粕可以有效地去除豆粕中抗营养因子，并降解大分子蛋白质生成小肽，同时还可生成多种益生菌，积累有益的微生物代谢产物，最终得到具有多种功能的优质蛋白饲料——发酵豆粕。国内外有大量研究表明，经微生物发酵处理的发酵豆粕抗营养因子含量少、富含小分子大豆肽、消化酶、维生素和未知生长因子[2]，是优于其他大豆产品的多功能优质蛋白质饲料。

发酵豆粕是经微生物发酵制得的一种蛋白类饲料。目前，市场上多为乳酸菌发酵的豆粕产品。发酵豆粕与普通豆粕的营养成分差异主要包括蛋白质含量、粗纤维含量、总消化能和抗营养因子含量等[3]。发酵豆粕经微生物的发酵作用，抗营养因子的含量有极大程度的下降[4]；发酵豆粕pH值较低，酸化可以激活胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、淀粉酶、脂肪酶、麦芽糖酶和乳糖酶等的活性，提高饲料的消化吸收效率；经过微生物的发酵作用，豆粕中的大分子蛋白有很大一部分变成了更容易消化吸收的小分子蛋白或小肽，而且这些小肽中还有一部分是具有抗菌活性的抗菌肽，其可以使仔猪免受有害病菌的侵害，从而保护仔猪更加健康地成长[5]；发酵豆粕的氨基酸比例也比豆粕更加的均衡，更有利于仔猪的生长；发酵豆粕还可以螯合一些微量元素、维生素等，减少流失，提高其利用率[6]。在发酵豆粕初期，主要是利用单一菌种来发酵豆粕，单一菌种发酵豆粕简单方便，具有一定的作用,多菌种发酵研究较少。本试验选用乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌作为发酵菌种，分别从A、B、C、D 4个不同的公司均购买乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌三种菌种，通过单菌种筛选试验选出本试验所用的合适菌种，再通过正交试验筛选出三种菌的最佳比例以达到最好的发酵豆粕制作效果，以期为发酵豆粕在畜牧业生产中的使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌为发酵豆粕的菌种。分别从A、B、C、D 4个不同的公司均购买乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌三种菌种，通过前期单菌种筛选试验，对比乳酸产量、酸溶蛋白含量、蛋白酶酶活、粗蛋白含量，确定本试验所用的乳酸杆菌活菌数为2×109U/g（购自C公司），酵母菌活菌数为20×109U/g（购自C公司），枯草芽孢杆菌活菌数为100×109U/g（购自D公司），豆粕为生豆粕。通过前期探索试验得出适宜的发酵参数见表1。

表1 发酵参数

1.2 试验设备和试剂

1.2.1 试验设备

分析天平：精度0.000 1 g；恒温水浴锅：精度±0.2℃；752型分光光度计；pHS-3C型pH计，0.01pH单位；离心机：3 000 r/min；凯氏定氮仪。

1.2.2 试验试剂

乳酸缓冲液（pH=3.0）；0.4 mol/l碳酸钠溶液；0.5 mol/l的NaOH溶液；10.00 mg/l干酪素溶液；100 μg/ml酪氨酸标准溶液；400 g/l NaOH溶液；硼酸吸收液；0.05 mol/l HCl溶液。10%三氯乙酸溶液。

1.3 试验设计

按正交表L16（43）设计试验发酵豆粕，因素水平见表2。

表2 发酵豆粕菌种配比L16（43）正交试验因素水平

通过测定发酵后豆粕的pH值、酸溶蛋白的量、蛋白酶酶活，从中选出最优组合及其最佳比例。发酵豆粕正交表L16（43）见表3。

表3 发酵豆粕菌种配比L16（43）正交试验

1.4 发酵豆粕制作方法

先将豆粕粉碎（过40目），称取160 g装入已编号的16个消毒具塞三角烧瓶中，按照正交表3称取相应的菌种于对应的三角烧瓶中，加入90 ml去离子水，混合均匀。将三角烧瓶置于28℃的厌氧培养箱中发酵2 d，发酵成熟。

1.5 测定指标与方法

1.5.1 发酵豆粕pH值的测定

称取发酵后的新鲜豆粕5 g于100 ml锥形瓶中，加入50 ml去离子水，搅拌30 min后，用pHS-3C型pH计测定溶液的pH值。

1.5.2 发酵豆粕蛋白酶酶活的测定

蛋白酶酶活的测定参照中华人民共和国SB/T10317-1999标准[7]。

1.5.2.1 酶样的制备

称取10 g新鲜发酵豆粕于250 ml锥形瓶中，加入100 ml乳酸缓冲液，搅拌溶解2 h，用慢速定性滤纸过滤，即得稀释10倍的酶液。

1.5.2.2 标准曲线的绘制

L-酪氨酸标准溶液按表4配制。

表4 L-酪氨酸标准溶液配制

分别取0～5号管中的溶液1 ml，加入0.4 mol/l的碳酸钠溶液5.00 ml，福林酚试剂1.00 ml，置于40℃水浴中显色20 min，用分管光度计在680 nm处比色，测定其OD值，绘制标准曲线，计算回归方程(见图1)。当OD值为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值。回归方程为y=0.010 2x-0.001 7，R2=0.999 1。

图1 蛋白酶标准曲线

1.5.2.3 样品的测定

先将干酪素溶液放入40℃水浴中预热5 min；取48支编号的10 ml离心管，各加入1 ml酶液，另取2支空白管加入1 ml乳酸缓冲液，同时加入2 ml三氯乙酸；1～48号离心管加入1 ml干酪素溶液，摇匀40℃准确反应10 min；取出离心管，1-48号加入2 ml三氯乙酸，空白管加入1 ml干酪素溶液静置10 min；

离心：3 000 r/min离心15 min，另取对应编号的离心管各取1 ml上清液，分别加入0.4 mol/l碳酸钠溶液5 ml，1 ml福林酚试剂。

在40℃水浴条件下显色20 min，680 nm处测OD值。

1.5.2.4 计算公式

式中：A为OD值；K为吸光常数；10为酶解反应时间；n为酶液稀释倍数。

1.5.3 酸溶蛋白的测定

将发酵好的豆粕于65℃烘干3 h，取出在干燥器中冷却30 min，称重。再同样烘干1 h，冷却，称重，直到2次质量差小于0.000 2 g。

称取6 g烘干好的发酵豆粕样品于100 ml烧杯中，加入75 ml 10%三氯乙酸，搅拌30 min。将所有液体用慢速定性滤纸过滤。

取15 ml上清液进行消化，凯氏定氮测量粗蛋白质的含量。

1.6 数据处理

试验数据采用Excel2007进行统计、计算。

2 结果与分析

2.1 不同菌种比例对发酵豆粕粗蛋白含量的影响

根据正交试验结果进行方差分析，比较各因素对发酵豆粕粗蛋白含量的影响。由方差分析结果（见表5）可知，每个因素对粗蛋白含量均有一定的影响，只是效果不同，影响因素的主次顺序是酵母菌＞乳酸杆菌＞枯草芽孢杆菌，即影响最显著的是酵母菌，其次是乳酸杆菌，影响最小的是枯草芽孢杆菌。由表5可知，乳酸杆菌为22 ml/kg时粗蛋白含量最高，酵母菌为4 mg/kg时粗蛋白含量最高，枯草芽孢杆菌为2.6 mg/kg时粗蛋白含量最高。所以最佳菌种配比为：乳酸杆菌22 ml/kg、酵母菌4 mg/kg、枯草芽孢杆菌2.6 mg/kg。

表5 正交试验不同菌种比例对发酵豆粕粗蛋白含量的影响

2.2 不同菌种比例对发酵豆粕酸溶蛋白含量的影响

根据正交试验结果进行方差分析，比较各因素对发酵豆粕酸溶蛋白含量的影响。由方差分析结果（见表6）可知，每个因素对酸溶蛋白含量均有一定的影响，只是效果不同，影响因素的主次顺序是乳酸杆菌＞枯草芽孢杆菌＞酵母菌，即影响最显著的是乳酸杆菌，其次是枯草芽孢杆菌，影响最小的是酵母菌。由表6可知，乳酸杆菌为22 ml/kg时酸溶蛋白含量最高，酵母菌为4 mg/kg时酸溶蛋白含量最高，枯草芽孢杆菌为2.2 mg/kg时酸溶蛋白含量最高。所以最佳菌种配比为：乳酸杆菌22 ml/kg、酵母菌4 mg/kg、枯草芽孢杆菌2.2 mg/kg。

表6 正交试验不同菌种比例对发酵豆粕酸溶蛋白含量的影响

2.3 不同菌种比例对发酵豆粕蛋白酶酶活的影响

根据正交试验结果进行方差分析，比较各因素对发酵豆粕蛋白酶酶活含量的影响。由方差分析结果（见表7）可知，每个因素对蛋白酶酶活均有一定的影响，只是效果不同，影响因素的主次顺序是枯草芽孢杆菌＞乳酸杆菌＞酵母菌，即影响最显著的是枯草芽孢杆菌，其次是乳酸杆菌，影响最小的是酵母菌。由表7可知，乳酸杆菌为22 ml/kg时蛋白酶酶活最高，酵母菌为4 mg/kg时粗蛋白酶酶活最高，枯草芽孢杆菌为2.2 mg/kg时蛋白酶酶活最高。所以最佳菌种配比为：乳酸杆菌22 ml/kg、酵母菌4 mg/kg、枯草芽孢杆菌2.2 mg/kg。

表7 正交试验不同菌种比例对发酵豆粕蛋白酶酶活的影响

2.4 不同菌种比例对发酵豆粕pH值的影响

根据正交试验结果进行方差分析，比较各因素对发酵豆粕pH值的影响。由方差分析结果（见表8）可知，每个因素对粗蛋白含量均有一定的影响，只是效果不同，影响因素的主次顺序是酵母菌＞枯草芽孢杆菌＞乳酸杆菌，即影响最显著的是酵母菌，其次是枯草芽孢杆菌，影响最小的是乳酸杆菌。由表8可知，乳酸杆菌为22 ml/kg时发酵豆粕pH值最低，酵母菌为4 mg/kg时发酵豆粕pH值最低，枯草芽孢杆菌为2.6 mg/kg时发酵豆粕pH值最低。所以最佳菌种配比为：乳酸杆菌22 ml/kg、酵母菌4 mg/kg、枯草芽孢杆菌2.6 mg/kg。

2.5 菌种最佳比例筛选试验结果

由上述试验可筛选出两组结果，第Ⅰ组：乳酸杆菌22 ml/kg、酵母菌4 mg/kg、枯草芽孢杆菌2.2 mg/kg；第Ⅱ组：乳酸杆菌22 ml/kg、酵母菌4 mg/kg、枯草芽孢杆菌2.6 mg/kg。由表9可知，两组粗蛋白、酸溶蛋白的含量差异不显著（P＞0.05），但蛋白酶酶活，第Ⅱ组显著高于第Ⅰ组（P＜0.05）。并且第Ⅱ组的pH值低于第Ⅰ组。所以，确定第Ⅱ组为最优菌种配比。即乳酸杆菌22 ml/kg、酵母菌4 mg/kg、枯草芽孢杆菌2.6 mg/kg。

表8 正交试验不同菌种比例对发酵豆粕pH值的影响

表9 最佳比例筛选试验结果

3 讨论

随着我国畜牧业的飞速发展，动物饲料蛋白资源供应短缺，严重依赖进口，研究可以替代鱼粉的新型植物蛋白源引起了广大科研工作者的关注。豆粕是我国当前使用最广泛的饲料蛋白原料，但饲用豆粕一般是高温豆粕，蛋白变性比较严重，溶解性较差，会影响蛋白的消化，而且还含有一定的抗营养因子和胀气因子。豆粕经过微生物发酵处理，不仅能够提高其粗蛋白含量，还能够降解存在的抗营养因子，改善蛋白质的质量，使经过发酵后的豆粕更有利于动物的消化吸收，是优于其他大豆产品的多功能优质蛋白质饲料。

国内外对于发酵豆粕的报道大多是单一菌种或者两种菌种混合发酵豆粕，很少有3种菌种混合发酵的研究。据邢力研究，用枯草芽孢杆菌和米曲霉混合菌种发酵豆粕比用单一菌种枯草芽孢杆菌发酵更有利于提高发酵豆粕营养水平，发酵豆粕最优的方案为枯草芽孢杆菌和米曲霉混合菌种比例为2∶1[8]。另根据研究报道，枯草芽孢杆菌与米曲霉混合比例为2∶1时，发酵豆粕中多肽含量显著高于1∶1组和4∶1组。同时，王哲奇也得出同样的结论：枯草芽孢杆菌与米曲霉混合比例为2∶1时，豆粕中大豆多肽含量显著高于其他2组（P＜0.05）。枯草芽孢杆菌与酿酒酵母接种比例为4∶1时大豆多肽含量显著高于其他2组（P＜0.05），与接种比例为2∶1时的发酵产物中的粗蛋白含量差异不显著，但显著低于接种比例为1∶1时的发酵产物中的粗蛋白含量，pH值差异均不显著（P＜0.05）[9]。本试验通过正交试验确定乳酸杆菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌3种菌的添加比例，得出3种菌的添加比例为乳酸杆菌22 ml/kg、酵母菌4.0 mg/kg、枯草芽孢杆菌2.6 mg/kg。本文通过正交试验确定发酵豆粕中乳酸杆菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌3种菌的最佳配比，为发酵豆粕的合理使用提供理论依据。使发酵豆粕能够更好地应用于生产实际，从而提高猪生产的经济效益，也为后续有关研究提供科学依据。

4 结论

发酵豆粕3种菌的添加配比为乳酸杆菌22 ml/kg、酵母菌4.0 mg/kg、枯草芽孢杆菌2.6 mg/kg，即乳酸杆菌44×109U/kg、酵母菌80×109U/kg、枯草芽孢杆菌260×109U/kg。