上海地区苜蓿附生乳酸菌中优良菌株的筛选和鉴定

■郭琳娜 王雁萍 袁世超 杨慧晓

（1.郑州大学离子束生物工程省重点实验室，河南郑州450052；2.安图生物工程科技股份有限公司，河南郑州450016）

近年来，随着我国畜牧业的持续发展以及种植业的积极调整使得苜蓿大规模种植及产业化开发快速推广成为可能。苜蓿自然附着戊糖片球菌、乳酸乳球菌、肠系明串珠菌、植物乳杆菌等乳酸菌，这些乳酸菌在青贮发酵过程中起着重要作用。

然而，苜蓿自然附生的乳酸菌量较少，为1×101～3×105CFU/(g·FW)[1]，难以达到所需数量，加之苜蓿可溶性糖含量低，一般在3.72%（DM）左右，无法达到发酵成优质青贮饲料所需的最低含糖量9.5%（DM）[2]，使得苜蓿在青贮过程中需要使用添加剂来提高青贮品质。乳酸菌是绿色环保的生物添加剂，筛选高抑菌活性及产酸性能，尤其是在低可溶性糖环境中产酸能力较强的优良乳酸菌，能够降低青贮饲料的pH值，有利于抑制有害菌的生长，从而达到长期保存饲料营养物质的目的[3]。

本试验旨在从上海地区苜蓿附生乳酸菌中筛选出抑菌活性较好，在低可溶性糖环境中产酸能力较强的优良菌株，为苜蓿青贮用乳酸菌添加剂的研究和开发提供参考。

1 实验材料

1.1 实验菌株

乳酸菌菌株共67株，均为实验室保存，分离自上海地区苜蓿的35个样品，其品种包括巨人802、金达、王冠、CW608、ST201、德福、AB1700、WL525、丰宝、射手等。

1.2 指示菌株

沙门氏菌(Salmonella enterica)、大肠杆菌(Escherichia coli)、李斯特氏菌(Listeriosis)，为实验室保存。

1.3 试剂及培养基

MRS培养基，NA培养基，过氧化氢酶，API 50。

2 实验方法

2.1 抑菌活性的测定

将保存于-80℃冰箱中的67株乳酸菌活化后，接种到MRS液体培养基，30℃培养24 h，制备乳酸菌发酵上清液(12 000 r/min、4℃离心10 min)；分别挑取各种指示菌的单菌落在NA培养基上划线，30℃恒温培养24 h制备指示菌菌悬液，采用牛津杯双层平板法[4]进行抑菌试验，并对实验结果进行统计分析。

2.2 产酸性能的测定

将活化的乳酸菌菌液按6%的比例接种于MRS液体培养基中，以不接种乳酸菌的MRS液体培养基作为空白对照，30℃静置培养。期间每隔2 h取1次样，连续取到36 h，测定pH值。

2.3 在葡萄糖浓度为0.5%的MRS液体培养基中乳酸菌发酵性能的检测方法

将筛选到的乳酸菌接种于葡萄糖含量为0.5%的液体MRS培养基中，以不接种乳酸菌的0.5%葡萄糖MRS液体培养基为对照，每12 h测定培养基的pH值进行统计分析。

2.4 乳酸菌发酵苜蓿粉性能的检测方法

将苜蓿放置于65℃烘箱48 h烘干水分，利用粉碎机将其粉碎，制备苜蓿粉备用。将活化后的菌株接种于MRS液体培养基，30℃培养24 h，制备乳酸菌菌液备用。称取苜蓿粉1 g于自封袋中，按66.7%的含水量加2 ml无菌水，并加入3 μl乳酸菌菌液，加菌处理的袋每种4份，不加菌的袋也有4份作为对照，混匀，密封，放置于30℃培养箱。分别于培养12、24、36、48 h后开封，开封后每袋样品中加入27 ml蒸馏水，充分混匀，测定其pH值进行统计分析。

2.5 菌株的理化特征测定方法

①耐盐浓度试验:将菌株分别接种于含有3.0%和6.5%NaCl的液体MRS培养基(pH值6.5)中，30℃培养48 h，对照组培养基为不含NaCl的MRS液体培养基。

②pH值生长范围试验:分别将菌株接种于pH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、9.0、10.0的MRS液体培养基中，30℃培养 7 d，对照组培养基为 pH值6.5的MRS液体培养基。

③温度生长范围试验:将菌株接种于pH值6.5的MRS液体培养基，分别放置于5、15、45、50 ℃下培养，其中45℃ 和50℃下培养 7 d，5℃和 15℃下培养14 d，对照组设置为30℃条件下培养7 d。

④菌株的过氧化氢酶试验、发酵葡萄糖产气试验（同型或异型发酵试验）、碳源发酵特性等，具体方法参照庞会利（2001）[5]。

2.6 分子生物学鉴定

将菌株接种于MRS固体平板上培养48 h备用。PCR引物选用细菌的16S rRNA基因扩增的通用引物 ：27F(5’-AGAGTTTGA-TCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。PCR 反应体系为50 μl：Premix Taq25 μl，27F和1492R（均为20 μM）1 μl，补充灭菌蒸馏水至50 μl，直接将菌落加入反应体系，进行PCR反应。将菌落PCR产物测序，结果在GeneBank中使用Blast程序寻找与其最大同源性的序列。并将测序所得16S rRNA基因序列和通过Blast在GenBank中得到的标准菌株序列信息一起导入CLUSTAL W软件进行比对。将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis NCDO 1769T作为外围菌株，采用MEGA 5.02软件中的邻接法构建进化树[6-7]。

3 结果与分析

3.1 乳酸菌的抑菌活性

在指示菌相同浓度下，67株上海地区苜蓿附生乳酸菌中对G+指示菌（李斯特氏菌）的抑菌率较高，而对G-指示菌（大肠杆菌和沙门氏菌）的抑菌率较低，如图1所示。对李斯特氏菌的抑菌率达77.61%，而对大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌率分别为65.67%和13.70%。

图1 上海地区苜蓿附生乳酸菌发酵上清液对指示菌的抑菌率

其中ZZU A95、ZZU A101、ZZU A104、ZZU A105、ZZU A106、ZZU A110和ZZU A157这7株菌对3种指示菌均有抑制作用。对李斯特氏菌抑制作用最强的是菌株ZZU A95，对大肠杆菌抑制作用最强的是菌株ZZU A104，对沙门氏菌抑制作用最强的是菌株ZZU A157，结果如表1所示。

3.2 乳酸菌的产酸性能

对上海地区苜蓿附生乳酸菌中具有较好抑菌作用的7株菌进行产酸性能的测定，发现所有菌株在0～12 h产酸速率较快，12～24 h逐渐变缓，24～36 h趋于平稳。其中 ZZU A95、ZZU A101、ZZU A104、ZZU A105这4株菌发酵12 h内的pH值下降较快，24 h后pH 值分别达到 3.57、3.99、3.85、3.96，均降至 4.0以下。结果如图2所示。

表1 乳酸菌的抑菌活性

图2 分离菌株不同时间发酵上清液pH值

3.3 乳酸菌在低可溶性糖条件下的发酵特性

3.3.1 在葡萄糖浓度为0.5%的MRS液体培养基中的发酵性能

将具有较强抑菌作用且产酸性能较好的4株菌在葡萄糖浓度为0.5%的MRS液体培养基中培养，结果如表2所示。所有试验菌株培养至12 h时培养基的pH值均降至5.0以下，其中菌株ZZU A95在培养至24 h时培养基的pH值最低，达到4.32，表明其在低糖环境中产酸性能最好。

表2 乳酸菌在葡萄糖浓度为0.5%的MRS液体中发酵不同时间的pH值

3.3.2 发酵苜蓿粉的性能

将具有较强抑菌作用且产酸性能较好的4株菌分别接种于苜蓿粉中进行发酵试验，每12 h开封测定苜蓿粉的pH值。结果如表3所示，试验组在发酵过程中苜蓿粉的pH值均低于不加菌的对照组。对照组苜蓿粉的pH值呈上升趋势，而除菌株ZZU A101外，接种其余乳酸菌发酵48 h时苜蓿粉的pH值均下降至5.0以下。其中接种菌株ZZU A95效果最好，在发酵至48 h时苜蓿粉的pH值降至4.78。

表3 发酵不同时间苜蓿粉的pH值

3.4 优良菌株的菌种鉴定

对具有较强抑菌活性和在低可溶性糖环境下产酸性能较好的ZZU A95菌株进行生理生化指标的测定,结果表明，ZZU A95是革兰氏染色阳性、过氧化氢酶反应阴性的同型发酵球菌；能够在pH值3.5、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0条件下生长，在pH值3.0条件下微弱生长；能够在5～45℃温度范围内生长；能够在NaCl浓度≤6.5%(W/V)的环境中生长。

碳源发酵结果如表4所示，菌株ZZU A95能够利用的碳源较广泛，能够很好地利用L-阿拉伯糖、核糖、D-木糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、α-甲基-D-葡萄糖甙、N-乙酰-葡糖胺、苦杏仁甙、熊果甙、七叶灵、柳醇、纤维二糖、麦芽糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、D-松二糖、D-塔塔糖这21种碳源，微弱利用D-阿拉伯糖和拢牛儿糖。

表4 菌株ZZU A95的碳源发酵特性

将ZZU A95菌株的16S rRNA(约1 500 bp)序列在GeneBank中使用Blast程序进行比对，结果表明，菌株ZZU A95与多株戊糖片球菌的16S rRNA序列相似性达99%以上。将其序列使用MEGA 5.02软件采用Neighbor-joining法构建的系统进化树见图3。

根据形态学、生理生化特性以及16S rRNA基因序列等特征将筛选的菌株ZZU A95鉴定为戊糖片球菌。

4 讨论

由于苜蓿自然附生乳酸菌对其材料本身具有较好的生长适应性，因此从中筛选适合用作青贮添加剂的优良乳酸菌方法更为有效。新鲜苜蓿的表面附着的有害菌，主要是肠杆菌目（Enterobacteriales）比例大[8]，例如大肠杆菌会引起畜禽肠道腹泻等疾病，对牲畜的健康造成极大的影响。而青贮时乳酸菌通过厌氧呼吸将青贮饲料中的碳水化合物转化为有机酸，使青贮环境的pH值下降，同时产生抑菌活性物质，抑制有害菌的生长，从而降低饲料在青贮过程中的营养消耗及腐败风险[9]。本研究通过对G+和G-指示菌的抑菌试验对上海地区苜蓿附生乳酸菌进行筛选，以期筛选在青贮过程中抑制腐败菌生长活性较强的乳酸菌。研究发现，所分离的67株乳酸菌中对李斯特氏菌（G+）的抑菌率较高，其中ZZU A95的抑菌圈直径最大，抑菌活性最佳，对大肠杆菌（G-）和沙门氏菌（G-）也有较好抑制作用。

图3 菌株ZZU A95的16S rRNA基因序列系统进化树

产酸性能是筛选青贮用优良乳酸菌的一个非常重要的指标[10]。本研究从抑菌实验筛选出的7株乳酸菌进行产酸性能测定。其中ZZU A95、ZZU A101、ZZU A104、ZZU A105这4株菌发酵24 h后pH值均降至4.0以下。其中ZZU A95的pH值最低，达到3.57，能够满足快速降低环境pH值的要求。

苜蓿的可溶性糖含量较低，因此，筛选能够在低可溶性糖环境中快速产酸的乳酸菌成为关键。本试验对4株产酸性能较好的乳酸菌进行低可溶性糖条件下的发酵试验，发现其均能够在葡萄糖浓度为0.5%的MRS液体培养基中生长，并降低环境的的pH值，其中菌株ZZU A95效果最为明显，并且菌株ZZU A95在发酵苜蓿粉过程中产酸较稳定。不接种乳酸菌的对照组和接种菌株ZZU A101、ZZU A104、ZZU A105的实验组在发酵36 h时苜蓿粉样品出现明显的酸臭气味，可能是由于这些样品中乳酸菌产酸量不足，不能有效抑制腐败菌的繁殖，在48 h时样品的气味恢复正常，可能与此阶段pH值未有明显上升有关。而接种菌株ZZU A95的苜蓿粉在发酵过程中未出现明显的酸臭气味，可能与菌株ZZU A95具有较强的抑菌活性和产酸性能有关。

苜蓿的细胞壁结构性糖（纤维素、半纤维素和木质素）含量丰富，然而不易被乳酸菌利用。而传统的青贮乳酸菌基本属于利用可溶性糖的乳酸菌，能否开发出分解植物细胞壁结构性糖的乳酸菌，促进纤维素及半纤维素的分解和利用，进而提高苜蓿青贮品质，是一个非常值得探索和深入研究的问题。本研究中，ZZU A95菌株可利用的碳源较多，包括纤维二糖和D-木糖。菌株ZZU A95是否具有降解结构性糖的相关酶基因和对结构性糖的分解能力，以及作为青贮用乳酸菌在生产中的实际应用效果，将有待进一步研究。

5 结论

从上海苜蓿附生乳酸菌中筛选的优良乳酸菌ZZU A95属于同型发酵兼性厌氧型乳酸菌，碳源利用较广泛，具有较强的抑菌活性和低可溶性糖环境下较好的产酸性能，可作为青贮用乳酸菌的潜在开发菌株。