绿色木霉、黄孢原毛平革菌和重组毕赤酵母混和发酵玉米秸秆制备饲料的工艺研究

■刘 盼 刘新利

（齐鲁工业大学生物工程学院，山东济南250300）

我国作为一个农业大国，植物纤维性农业废弃物的含量非常高，以农作物秸秆为例，我国农作物秸秆的产量位于世界前列，2009年农作物秸秆的产量为7.4亿吨。农作物秸秆分布范围广，数量大，并且含有碳水化合物、蛋白质、脂肪和无氮浸出物等化学成分，据研究分析，每千克玉米秸秆干物质消化能9.35 MJ，如果充分利用可以为国家节约大量的粮食，因此具有作为饲料原料的潜力，但是由于它们比较粗硬、适口性不好、营养价值较差、消化利用率比较低等特点，实际上作为饲料的植物纤维性农业废弃物的量很低。另外单胃动物一般不能利用秸秆，反刍动物对秸秆的消化率也仅有20%～30%。如果想要将植物纤维性农业废弃物作为一种饲料就必须对其进行加工处理，增加其营养价值，提高动物的采食量和消化率。

绿色木霉和枯草芽孢杆菌可以产生纤维素酶，黄孢原毛平革菌能够产生降解木质素的酶。重组毕赤酵母产生的阿魏酸酯酶为半纤维素降解酶系的组成之一，参与植物细胞壁的交联部分的分解，可以将半纤维素之间以及半纤维素与木质素之间的酯键打断，释放阿魏酸等酚酸类物质，促进半纤维素、木质素和纤维素的分离，为纤维素的进一步酶解提供条件。绿色木霉和黄孢原毛平革菌分别是重要的纤维素降解菌和木质素降解菌。本文主要是利用绿色木霉、黄孢原毛平革菌和重组毕赤酵母（阿魏酸酯酶）对植物纤维性农业废弃物玉米秸秆进行降解。

1 材料与方法

1.1 试剂材料

玉米秸秆，来自济南市长清区，烘干粉碎过50目筛，原材料中的纤维素、半纤维素和木质素含量分别为41%、25%和16%。

1.2 培养基

YPED培养基：1%酵母浸粉、2%蛋白胨、2%葡萄糖、水1 000 ml。

YPED固体培养基：配方同上，再加2%的琼脂。

PDA培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、水1 000 ml。

发酵培养基：PDA液体培养基加研磨后的玉米秸秆（过50目筛）。

1.3 方法

1.3.1 四株菌之间的拮抗作用

为了探究四株菌在玉米秸秆发酵过程中有无拮抗作用，进行了四株菌之间的拮抗试验。在YPED培养基平板上划四个区，分别在每个区接一株菌，30℃倒置培养，3 d后观察，选择无拮抗作用的菌株进行后续试验。

小说家又说：“日本童话大师安房直子有一篇童话《狐狸的窗户》，讲述了一个小狐狸开了一家印染店的故事。如果小狐狸不狡猾，它能开成印染店吗？”女孩似乎听明白一些，点点头，而富翁却像听傻了一般，双眼直勾勾地盯着小说家。

1.3.2 混合菌液发酵玉米秸秆制备饲料

准确称取适量的玉米秸秆，添加相同比例的相互间无拮抗作用的绿色木霉、黄孢原毛平革菌和重组毕赤酵母的混合菌液，控制适当温度、pH值、固液比和培养时间，测定还原糖含量。

1.3.3 还原糖含量的测定

利用还原糖测定仪测定还原糖含量。

1.3.4 纤维素、半纤维素和木质素的测定

利用NREL法测纤维素、半纤维素和木质素含量。

2 结果与分析

2.1 四株菌之间的拮抗

在YPED培养基平板上划四个区，将培养到对数期的绿色木霉、黄孢原毛平革菌、枯草芽孢杆菌和重组毕赤酵母分别接种在不同的区上，30℃倒置培养，3 d后观察，试验结果见图1。

图1 混合菌液处理之后的玉米秸秆的红外光谱图

由图1可以看出，枯草芽孢杆菌对毕赤酵母、绿色木霉和黄孢原毛平革菌有抑制作用，能看到明显的抑菌圈，其余的三株菌之间没有明显的抑菌圈，可以共生长。所以本试验选择绿色木霉、黄孢原毛平革菌和重组毕赤酵母作为秸秆处理的微生物菌株。

2.2 三株菌的添加顺序

取90 ml PDA培养基和10 g玉米秸秆，115℃灭菌30 min。由于重组毕赤酵母需要甲醇的诱导，故将重组毕赤酵母放在最后。因此三株菌的添加顺序按照两种不同的方案进行，第一种方案是加入10 ml绿色木霉，培养2 d后再加10 ml黄孢原毛平革菌，再培养2 d后加入10 ml重组毕赤酵母，培养1 d后加1 ml甲醇诱导。第二种方案与第一种方案相似，只是先添加黄孢原毛平革菌后添加绿色木霉。对照组加相应的灭菌的蒸馏水。测定还原糖的含量，试验结果见图2。

图2 菌的添加顺序对还原糖产量的影响

由图2可知，第一种方案比第二种方案的还原糖的含量高。测样的第7 d产生的还原糖的量为8.863 mg/ml，与王巍杰等采用白腐真菌降解玉米秸秆制备饲料时在30℃、pH值8.5和固液比1∶15的条件下发酵72 h，玉米秸秆饲料中还原糖含量增加13.77%发酵相比，本试验还原糖产生量不如王巍杰等人的高，但是比先添加黄孢原毛平革菌的试验组的产还原糖量高26.9%。所以本试验采用第一种方案的添加顺序进行后续试验。

2.3 混合菌液处理秸秆的温度优化

混合菌按照上述第一种方案对玉米秸秆发酵处理的温度优化。发酵液分别在20、25、30、37、42 ℃温度下，200 r/min摇床培养，甲醇诱导结束后开始测样，对照组加相应的灭菌的蒸馏水。测定还原糖含量，试验结果见图3。

由图3可知，当培养温度为30℃时，秸秆的发酵效果最好；发酵周期大约在测样的第9 d，还原糖的最高产量为12.424 mg/ml。比朱易佳用pH值4.5的稀碱预处理稻秆后再加入发酵稻秆的混合酶制剂（阿魏酸酯酶、木聚糖酶、纤维素酶）在45℃下酶解12 h，酶解产生的还原糖为0.06 g/g相比，还原糖产生率高50%。发酵后期还原糖产量的降低可能主要是菌株老化导致产酶量降低和菌株自身新陈代谢的消耗。

2.4 混合菌液处理秸秆的pH值优化

对混合菌液处理秸秆的pH值在4、5、6、7、8、9的范围内进行优化，30℃、200 r/min条件下，操作同菌液添加顺序的第一个方案，对照组加相应的灭菌的蒸馏水。测定还原糖的含量，试验结果见图4。

图4 菌的培养pH值对还原糖产量的影响

由图4可知，随着pH值的增加还原糖产量也逐渐增加，但是菌液在pH值为7时对秸秆的降解效果最好，还原糖的产量最高，为13.291 mg/ml。但是与Tabka等将蒸汽爆破的小麦秸秆添加0.1%（w/v）的Tween20和阿魏酸酯酶、纤维素酶、木聚糖酶，在50℃条件下共同作用，释放了51.4%的还原糖相比，还原糖的产生量低，可能是因为Tween20对秸秆的酶解反应有一定的促进作用。

2.5 混合菌液处理秸秆的固液比优化

对混合菌液处理秸秆的固液比在1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12、1∶15的比例下进行优化。30 ℃，200 r/min、pH值7.0的条件下，菌液的添加顺序按照第一个方案进行，对照组加相应的灭菌的蒸馏水。测定还原糖的含量，试验结果见图5。

由图5可知，当固液比为1∶9时，混合菌液对玉米秸秆的降解效果最好，产生的还原糖的量最大。

图5 菌的培养固液比对还原糖产量的影响

2.6 纤维降解率与红外分析

最后发酵完成之后发酵液的状态如图6所示，由图6可以看出，玉米秸秆处理前发酵液比较黏稠，处理后由于纤维类物质的降解，结构疏松，发酵液静止1 h后能明显看出澄清液体。最后利用NERL法测定混合菌液处理后的玉米秸秆中的纤维素、半纤维素和木质素含量分别为32%、22%和11%；降解率分别为21.95%、12%和31.25%。

从图7看出，玉米秸秆经过混合菌液协同处理之后的结构发生改变，主要表现在阿魏酸酯键、木质素的芳环和纤维素上的碳氧双键伸缩振动的特征吸收峰的变化，它们的特征吸收峰分别为1 700 cm-1、1 600 cm-1、1 300 cm-1左右。没有经过混合菌液处理的玉米秸秆的阿魏酸酯键、木质素和纤维素的特征吸收峰与经过混合菌液处理之后的其相应的特征吸收峰强。这说明三种菌株之间的协同处理玉米秸秆的作用比较明显，秸秆的降解效果好。

图6 秸秆处理前后对比（左边处理前，右边处理后）

图7 混合菌液处理之后的玉米秸秆的红外光谱

3 讨论与结论

通过研究发现，当绿色木霉、黄孢原毛平革菌和毕赤酵母（重组阿魏酸酯酶）以相同比例对玉米秸秆进行发酵时，以还原糖产量作为考察指标确定玉米秸秆饲料制备的最佳工艺为：玉米秸秆添加量10 g、pH值7，固液比1∶9在30℃培养9 d。混合菌液对玉米秸秆的降解效果良好，能够有效地降解玉米秸秆中的纤维素和木质素，为今后的产业化提供了试验基础。目前，专家学者对秸秆降解的研究多停留在液体培养的条件下。本试验以玉米秸秆作为半固体基质，对绿色木霉、黄孢原毛平革菌和阿魏酸酯酶重组菌株毕赤酵母的混合菌液进行半固体处理，寻找出一种有效地降解玉米秸秆的方法，为后期将玉米秸秆的饲料化提供了理论基础。本次试验只是涉及了实验室培养阶段，对于大规模的工程培养和动物实验还需要进一步研究。

（参考文献10篇，刊略，需者可函索）