补骨脂素对胃癌细胞株BGC-803增殖和凋亡的影响及其机制

补骨脂素对胃癌细胞株BGC-803增殖和凋亡的影响及其机制

闫伟伟1,3,章永红1,刘军楼1*,吴坚2,邹玺2,刘沈林2,杨继兵1,于希忠1

(1.南京中医药大学,南京 210023;2.南京中医药大学第一附属医院,南京210029;

3.南阳市第一人民医院,南阳 473010)

摘要：目的研究补骨脂素对人胃癌BGC-803细胞的增殖和凋亡的影响并探讨其机制。方法以不同浓度的补骨脂素作用于体外培养的胃癌细胞BGC-803，不同时间后，采用MTT法检测药物对肿瘤细胞生长抑制率，流式细胞仪检测细胞凋亡率,激光共聚焦显微镜观察F-actin形态学变化。结果补骨脂素对人胃癌细胞株BGC-803具有明显的生长抑制作用，并与药物剂量及处理时间成正相关。补骨脂素作用于细胞24、48、72 h后的IC50分别为92.6、25.54、7.68 μg/mL。流式细胞仪检测结果显示给药组早期凋亡的百分率显著高于对照组，细胞骨架蛋白F-actin呈现解聚状态。结论：补骨脂素可抑制胃癌BGC-803细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，其机制可能是药物引起了细胞骨架蛋白F-actin解聚。

关键词：补骨脂素；胃癌；抑制增殖；细胞凋亡；细胞骨架蛋白

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.10.028

中图分类号：R285.5文献标志码： A

文章编号：1003-5699(2015)10-1064-04

基金项目:江苏高校优势学科建设工程(中西医结合)资助项目(PAPD)；江苏省中医药局课题资助项目(JD11038)。

作者简介:闫伟伟(1988-)，男，2012级硕士研究生，主要从事中医肿瘤病学研究。

收稿日期:(责任编辑：赵玉芝2015-03-30)

*通信作者:刘军楼，电话-13585148565，电子信箱-liujunlou1975@126.com

Psoralen on proliferation and apoptosis of gastric cancer cell line BGC-803 and its mechanism

YAN Weiwei1,3,ZHANG Yonghong1,LIU Junlou1,WU Jian2,ZOU Xi2,LIU Shenlin2,YANG Jibing1,YU Xizhong1

(1.Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China;

2.The First Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210029,China;

3.The First People's Hospital of Nanyang,Nanyang 473010,Henan Province,China)

Abstract:ObjectiveThis experiment aims at observing the inhibition effects of Psoralen and apoptosis on human gastric carcinoma BGC-803 cells,discusses the possible mechanisms.MethodsBGC-803 cells in culture medium were treated with different concentrations of Psoralen.After different time period,the inhibitory rate of the cells was measured by MTT assay.Cell apoptotic rate was detected by flow cytometry (FCM).The morphological changes of F-actin were observed by laser confocal microscopy.ResultsThe growth of human gastric carcinoma BGC-803 cells was significantly inhibited by Psoralen,as the concentration increasing and the work time extending,the inhibition grows,which could be concluded as time-dose dependence.IC50 of Psoralen was respectively 92.6,25.54,7.68 μg/mL after 24 hours,48 hours,72 hours.The early apoptotic rate of BGC-803 cells was significantly higher than the control group’s.F-actin cytoskeletal protein was showed from polymerization to depolymerization after Psoralen treatment.ConclusionPsoralen can obviously inhibit the proliferation and induce apoptosis of BGC-803 cells.The mechanisms may involve the depolymerization of F-actin after treatment with Psoralen.

Keywords:psoralen;gastric carcinoma;antiproliferation;apoptosis;cytoskeletal protein

胃癌是严重威胁人类健康的重大疾病之一，发病率及死亡率逐年增加，对社会及家庭带来了沉重的压力及负担[1-5]。中医药治疗恶性肿瘤毒副作用低且疗效显著，对防治胃癌有较大的潜力与优势。中药补骨脂为豆科植物，性辛、苦、温，入肾、脾经，具有补肾壮阳，纳气平喘，暖脾止泻等作用，主要用于治疗肾虚阳痿、腰膝冷痛、脾肾阳虚之五更泄泻等。现代研究发现,补骨脂主要提取物之一补骨脂素(Psoralen)对JB6皮肤癌细胞株、膀胱癌细胞株、肝癌细胞株、人乳腺癌细胞株等多种肿瘤细胞均有明显的生长抑制作用[6-7]。鲜见文献报道补骨脂素对胃癌细胞有抑制作用，但对其作用机制尚无文献报道，也未见补骨脂素作用于细胞骨架蛋白的研究报道。本文研究补骨脂素对人胃癌BGC-803细胞的增殖、凋亡及细胞骨架蛋白F-actin的影响，探究其可能机制，为其进一步应用于临床治疗胃癌提供有力的实验依据。

1材料和方法

1.1实验药物及细胞株补骨脂素购自泽朗医药科技有限公司(纯度≥98%)；人胃癌BGC-803细胞株由江苏省中医院肿瘤内科实验中心惠赠。BGC-803细胞用含10%小牛血清的DMEM培养基培养于25 mL塑料培养瓶中，37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱常规培养。补骨脂素用DMSO溶解后加入三蒸水，配制成含10% DMSO浓度为100 mmol/L的母液，-4 ℃保存，应用时加培养基稀释成目标浓度(DMSO的终浓度≤0.01%，无明显细胞毒作用)。

1.2实验试剂小牛血清(杭州四季青)；DMEM高糖培养基(赛默飞世尔);胰蛋白酶+EDTA、MTT试剂盒(凯基生物)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(BD)；DMSO(Sigma)：CytoPainter Phalloidin-iFluor 594 Reagent (Abcam)。

1.3主要仪器设备MCO-20A IC二氧化碳培养箱(SANYO)，超净工作台，MDF-382超低温冰箱(SANYO)，IX50型倒置显微镜(Olympus)，Biophometer分光光度计(EPPENDORF)，5417型低温高速离心机(EPPENDORF)，FACScan型流式细胞仪(Becton Dickinson)，激光共聚焦显微镜(Leica)等。

1.4实验方法

1.4.1细胞增殖抑制率的测定(MTT法)采用噻唑蓝(MTT)还原法进行检测：取对数生长期BGC-803细胞，用培养基将细胞稀释至最终浓度为0.4×105/mL,然后混合均匀以每孔100 μL接种于无菌的96孔培养板中，继续培养12 h后待细胞完全贴壁，移除上清液，分别加入含100、50、25、12.5、6.25 μg/mL补骨脂素的DMEM培养基100 μL，每种浓度均设6个平行孔；对照组加入不含药物的DMEM培养基100 μL。继续将培养板置于孵箱中分别培养至24、48、72 h后，于终止培养前4 h，分别向各孔均加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，然后放至孵箱内继续培养4 h后弃上清液，各孔加入DMS0 150 μL后将培养板避光置于振荡器上振荡5～10 min溶解蓝色结晶,以酶标仪于550 nm处读取各孔吸光度值(A550)，计算细胞生长抑制率与IC50。细胞生长抑制率(%)=[对照组A值—实验组A值]/对照组A值×100%。实验重复3次。

1.4.2流式细胞仪检测细胞凋亡取对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×105/mL，然后混合均匀，按每孔2 mL接种于无菌的六孔板中。培养12 h后待细胞完全贴壁后移除上清液，分别加入含50、30、25、20 μg/mL补骨脂素的DMEM培养基2 mL，空白对照组加入不含药物的DMEM培养基继续培养。药物处理细胞48 h终止培养，弃上清液，加入含EDTE的胰酶0.5 mL消化3 min后，加入含小牛血清的DMEM培养液终止消化，并用移液器将细胞移至10 mL离心管内，以1 000 r/min，5 min离心后移除上清液，向试管内加入500 μL Binding Buffer轻轻吹打，使细胞重悬均匀，然后加入5 μL PI试剂和5 μL Annexin V-FITC试剂，混匀后避光孵育15 min，然后用流式细胞仪检测。

1.4.3免疫荧光显微镜下观察补骨脂素对BGC -803细胞骨架结构的影响具体操作步骤为：1)细胞爬片：将盖玻片清洗后高温灭菌，烘干后平放到六孔板内，将BGC-803细胞用含10%小牛血清的DMEM培养液在37 ℃、5%CO2培养箱中培养,待细胞生长良好进入对数期后收集细胞，用DMEM培养液将细胞稀释，利用细胞计数板在显微镜下计数，直到细胞浓度为1×105/mL，然后混合均匀,按每孔2 mL接种于无菌的六孔板中。培养12 h后待细胞完全贴壁，移除上清液，PBS清洗3次后分别加入含50、30、25、20 μg/mL补骨脂素的DMEM培养基2 mL,空白对照组加入不含药物的DMEM培养基继续培养。2)细胞固定：药物处理细胞48 h后停止培养,用PBS漂洗3次，然后向盖玻片上滴加4%的多聚甲醛200 μL，将六孔板放至冰上固定30 min后，用PBS漂洗3次，然后用棉签吸除盖玻片周围的水份，加入0.1% Triton 100 μL，以覆盖盖玻片为度，静置5 min后用PBS再漂洗3次。3)染色：加入100 μL 1×Phalloidin工作液室温放置90 min，常温下PBS漂洗3次后于荧光显微镜上观察并摄影。

2结果

2.1补骨脂素对BGC-803细胞的生长抑制作用不同浓度的补骨脂素(6.25～100 μg/mL)分别作用于BGC-803细胞24、48、72 h，与对照组比较，结果显示:补骨脂素对人胃癌细胞株BGC-803的增殖有明显的抑制作用，并有时间及浓度的依赖性。随着药物浓度的递增及处理时间的增加，其对细胞的抑制率也显著上升(P<0.01)；在处理时间相同的情况下,当药物浓度达到100 μg/mL时，对BGC-803细胞的抑制作用达到最强。结果见表1,根据公式分别计算出补骨脂素作用人胃癌细胞株BGC-803 24、48、72 h后各自IC50值，结果见表2。

表1　补骨脂素对人胃癌细胞株BGC-803的抑制率 ± s)

注：和对照组相比，#P<0.05,##P<0.01

表2　不同时间补骨脂素作用于人胃癌细胞株BGC-803的IC 50值μg/mL

2.2流式细胞仪检测补骨脂素对人胃癌BGC-803细胞的凋亡比率以50、30、25、20 μg/mL的补骨脂素作用于BGC-803细胞48 h后，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，药物浓度为20 μg/mL时，早期凋亡率达到8.34%；并且随着药物浓度的增加，早期凋亡率由8.34%，分别增加至9.47%、28.13%和60.16%。与空白对照组3.11%相比，均有统计学意义(P<0.01)。

2.3激光共聚焦显微镜观察细胞骨架蛋白F-actin的形态学变化细胞经药物处理48 h后可见：同等培养条件下，鬼笔环肽(phalloidin)能和细胞的纤维肌动蛋白F-actin特异性的结合，由FITC-phalloidin标记的细胞F-actin呈橘红色荧光，空白对照组细胞生长状态良好，周围生有多个伪足，细胞大致呈梭形或者多边形生长，细胞内骨架清晰完整，染色均匀，呈网状分布，紧密地排列在细胞核周围及细胞膜内侧，并可见细胞内大量骨架蛋白从细胞膜一侧贯穿至另一侧，与细胞质紧密相连,排列整齐有序。而分别经浓度为25、30、50 μg/mL补骨脂素处理后的细胞，镜下可见细胞周围伪足数目明显减少，呈蜷缩状态。细胞内骨架蛋白排列紊乱，荧光染色较浅，表明骨架蛋白数量较少，排列杂乱无章，并且细胞质之间无相连骨架蛋白，且细胞骨架蛋白排列随着药物浓度的增加越来越紊乱，数量也越来越少，与未加药物组相比，明显出现了细胞骨架的解聚。

3讨论

目前胃癌的治疗主要以手术及放化疗为主，手术是胃癌根治的主要途径，但是关于术后的复发转移、病人体质的恢复及放化疗后的毒副反应的耐受程度，西医对症处理疗效仍不理想。近些年关于中医药抗肿瘤的研究取得了巨大的进展，并且在中医药的复方及单味药的研究方面取得了丰富的经验。

本实验以胃癌细胞株BGC-803为研究对象，应用多种方法观察补骨脂素对肿瘤细胞的影响。结果显示，补骨脂素能够抑制胃癌细胞的增殖并且药物剂量和作用时间呈正相关；进一步观察补骨脂素对胃癌细胞凋亡的影响，发现给药组早期凋亡的百分率显著高于对照组，证实其能够诱导细胞的凋亡，说明其抑制肿瘤细胞增殖作用可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关。

细胞骨架是细胞内蛋白质成分组成的网络结构，包括微管、微丝和中间纤维。微丝是3种骨架结构中最细的，主要由actin组成，以游离球状actin(G-actin)或聚合纤维状actin(F-actin)形式存在。RAO J等[8]研究表明，actin聚合/解聚状态的改变，即actin骨架重组，对恶性肿瘤细胞的形态和表型有非常重要的调节作用,认为干预细胞骨架微丝actin重组可作为抗癌药物的作用靶点，也可作为研发新的抗肿瘤药物的依据。本实验通过F-actin抗体免疫荧光染色法观察Psoralen对肿瘤细胞骨架蛋白影响，研究结果提示药物干预后引起了F-actin聚合/解聚状态的改变，主要可能是药物引起了F-actin解聚,导致F-actin相对减少而G-actin相对增加，从而呈现细胞内骨架蛋白排列紊乱，细胞质荧光染色减弱。

大量的研究证明，补骨脂素对多种肿瘤细胞的生长都有抑制作用，其主要机制包括影响细胞的DNA合成、诱导细胞产生凋亡、阻滞细胞周期、抑制肿瘤血管生成、预防肿瘤转移等。目前尚无补骨脂素诱导胃癌细胞凋亡机制的报道。细胞凋亡时actin细丝发生断裂，actin网络结构遭到破坏，这是细胞凋亡时形态改变的一个典型特征，那么通过改变这一典型特征是否就能导致细胞凋亡呢？对此，WHITE S R等[9]作了深入的研究。他们用细胞松弛剂D抑制气管1HAEo细胞和主支气管上皮细胞actin的延伸,或通过Jaspakinolide促进actin的聚集，发现改变actin的整体性会导致细胞在5 h内出现典型的凋亡形态学改变。该研究提示，actin可能是细胞凋亡早期的调控物之一，进一步研究表明，通过改变actin稳定状态，可以导致凋亡的发生[10-11]。F-actin的解聚是凋亡过程中所必须的，其解聚出现在凋亡小体形成之前。actin是Caspases蛋白水解酶的作用底物，当Caspases攻击actin时，可将其切断降解为15kD和31kD两个片段，使之不能重新聚合，并由于15kD片段的形成而引起细胞凋亡形态的改变[12]。本研究发现，Psoralen可抑制胃癌细胞株BGC-803增殖，促进肿瘤细胞凋亡，同时药物干预后引起了actin状态的变化,即细胞骨架蛋白F-actin解聚，分析其作用机制可能是药物引起了F-actin解聚从而导致了凋亡的发生。至于F-actin解聚是否由于Caspases蛋白水解酶作用尚有待进一步研究。

国内外尚无补骨脂素作用于细胞骨架蛋白抗肿瘤的实验报道，上述研究结果表明，补骨脂素可抑制抑制胃癌细胞的增殖，促进肿瘤细胞凋亡，其作用机制可能是药物干预后引起了F-actin解聚从而导致了凋亡的发生。本研究结果提示，补骨脂素作为一种有良好活性的抗癌中药制剂提取物，具有很好的临床应用和开发价值，但其抗癌作用机理有待进一步深入研究。

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