外湿对大鼠各肠段菌群的影响

2016-01-09王菁,刘晓燕,黄晓宇

吉林中医药 2015年10期

外湿对大鼠各肠段菌群的影响

王菁1,刘晓燕2*，黄晓宇2

(1.北京市宣武中医医院,北京 100050;2.北京中医药大学基础医学院，北京 100029)

摘要：目的通过人工控制湿度，观察大鼠空肠、回肠和结肠的大肠杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌的菌落数，进而阐述外湿对肠道的影响，为湿邪致病阐明机制。方法将SD雄性大鼠随机分为常湿组、高湿组、低湿组，饲养21 d后，取空肠、回肠和结肠，分别进行大肠杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌平板计数。结果高湿组大鼠的空肠〔(4.50±0.09) logN/mL〕和结肠中大肠杆菌菌落值〔(7.30±0.38) logN/mL〕明显升高(均为P<0.05);低湿组大鼠空肠乳酸杆菌明显增多〔(6.09±0.13) logN/mL〕,P<0.01；低湿组空肠、回肠和结肠的双歧杆菌均非常明显的增多〔(5.86±0.31),(5.94±0.33) ,(7.07±0.16) logN/mL〕,均为P<0.01；高湿组结肠双歧杆菌的菌落值较为明显的升高〔(6.60±0.22) logN/mL〕,P<0.05。结论外湿对机体肠道内环境有明显的影响作用，改变了肠道菌群结构，从而导致疾病的产生。

关键词：外湿；中医脾脏；肠道菌群；大鼠

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.10.023

中图分类号：R223.1文献标志码： A

文章编号：1003-5699(2015)10-1046-03

基金项目:国家科技支撑计划课题(2012BAJ02B05)；国家自然科学基金资助项目(81001482)。

作者简介:王菁(1987-)，女，硕士，医师，主要从事脾胃病相关机制的研究。

收稿日期:(责任编辑：赵玉芝2015-01-26)

*通信作者:刘晓燕，电话-13693318075，电子信箱-liuxy1088@sina.com

Effects of exopathic dampness on intestinal flora of rat

WANG Jing1,LIU Xiaoyan2*,HUANG Xiaoyu2

(1.Beijing Xuanwu TCM Hospital,Beijing 100050,China;

2.Preclinical Medical College of Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

Abstract:ObjectiveTo obverse the number of E.coil,lactobacillus,bifidobacterium in jejunum,ileum and colon by controlling the relative humidity,and then to reveal the effect of exopathic dampness towards intestinal tract.MethodsThe mice were divided into normal temperature normal humidity environment (NNE),normal temperature high humidity environment (NHE),and normal temperature low humidity environment (NLE) group,6 mice in each group.After 21 days feed,5 cm samples were taken out from jejunum,ileum and colon respectively,and then put the three samples in 4ml normal saline.Finally test the number of E.coil,LBA and BFB in the three samples by using plate count method.ResultsThe numbers of jejunum 〔(4.50±0.09) logN/mL〕 and colon E.coil 〔(7.30±0.38) logN/mL〕 in NHE group were obviously higher than those of NNE group (P<0.05).The number of jejunum lactobacillus in NLE group was much increased,compared with that of NNE group 〔(6.09±0.13) logN/mL〕,P<0.01.The numbers of jejunum 〔(5.86±0.31) logN/mL〕,ileum 〔(5.94±0.33) logN/mL〕 and 〔(7.07±0.16) logN/mL〕 were obviously higher in NLE group than those of NNE group (P<0.01).The number of colon bifidobacterium in NLE group was higher,contrasted with that of NNE group 〔(6.60±0.22) logN/mL〕,P<0.05.ConclusionExopathic dampness impacted obviously on intestinal environment,change the structure of intestinal flora to cause disease.

Keywords:exopathic dampness;spleen of TCM;intestinal flora;mouse

湿邪有内外之分。外湿作为外感病的致病因素，属六淫之一，多为外伤雾露、冒雨涉水、坐卧湿地、居处潮湿、汗出贴衣、气候潮湿等所感受的外界湿邪。湿邪是引起人体疾病的常见重要因素和发病条件之一。《素问·阴阳应象大论》有云“风胜则动，热胜则肿，寒胜则浮，燥胜则干，湿胜则濡泻”。外湿侵入机体易伤脾。脾胃为水谷之海，可化生精微、津液，对津液的输布至关重要[1]，故湿邪外感，留滞体内，常先困脾，而使脾阳不振，运化无权，水湿停聚，发为腹泻[2]。而现代研究证明[3-5]，中医脾与肠道正常菌群之间存在着十分密切的关系，脾虚泄泻与肠道菌群的失调密切相关。因此，本研究尝试从肠道菌群的角度，探讨外湿影响机体肠道功能的作用机制。

1材料

SD大鼠，雄性，体质量180～200 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号码:SCXK(京)2006-0009。磷酸盐缓冲液(PBS)、结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)、结晶紫中性红胆盐-4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖苷琼脂(VRBA-MUG)、生理盐水、MRS琼脂、莫匹罗星锂盐(Li-Mupirocin)、10%水合氯醛、双蒸水。恒温培养箱、冰箱、无菌操作台、天平、三洋高压灭菌锅、水浴锅、微量移液器及吸头、移液器及移液管、无菌培养皿、锥形瓶、量筒、试管。

2研究方法

2.1动物分组将实验动物随机分组常湿组、低湿组、高湿组，每组各6只，饲养于温度(25±1) ℃，饲养21 d，喂普通饲料。常湿组:湿度控制在(60±5)%的人工模拟环境。低湿组：湿度控制在(30±5)%的人工模拟环境。高湿组：湿度控制在(90±5)%的人工模拟环境。

2.2取材21 d后，用10%水合氯醛，按30～40 mg/kg腹腔注射麻醉，固定，无菌操作,开腹腔取出空肠、回肠和结肠，取每段肠段上端5 cm剖开，在4 mL的生理盐水中涮洗，取得样品液体4 mL。

2.3细菌平板计数将样品液体稀释到100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，选择4个连续的适宜稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1 mL。同时取1 mL稀释液加入无菌平皿做空白对照，接种到大肠杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌的平板培养，大肠杆菌的平板在(36±1) ℃培养18～24 h，双歧杆菌和乳酸杆菌的平板在(36±1) ℃，厌氧培养(48±2) h后计数，报告每mL样品中菌数的对数值，以Log N/mL表示。

3结果

3.1外湿对各个肠段大肠杆菌的影响通过人工控制湿度，观察湿度对大鼠各个肠道的大肠杆菌的影响，见表1。

logN/mL

注：与常湿组比较，#P<0.05

3.2外湿对各个肠段乳酸杆菌的影响人工调控环境湿度对大鼠进行干预，见表2。

logN/mL

注：与常湿组比较，##P<0.01

3.3外湿对各个肠段双歧杆菌的影响调控环境湿度，观察大鼠空肠、回肠和结肠的双歧杆菌变化，见表3。

logN/mL

注：与常湿组比较，#P<0.05，##P<0.01

4讨论

中医学认为，人体的生命活动会受到外界环境的影响，如《灵枢·邪客》中：“此人与天地相应者也”，揭示了在预防疾病及诊治疾病时，应注意自然环境及阴阳、四时、气候等诸因素对疾病的影响。无论是正常气候还是异常气候，都与季节、时令的变化相关，故六淫致病与季节、时令有关。如春季多为风邪致病，夏季多暑热病邪致病，长夏多湿邪致病，秋季多燥邪致病，冬季多寒邪致病。现代研究发现[6-7]，季节气候变化会对机体肠道免疫功能产生影响，在长夏季节空肠和回肠的免疫因子明显升高。长夏多湿邪，特别是高湿环境下[8],初期大鼠的免疫自稳状态发生变化，免疫功能升高，随着时间的推移，机体又通过自我的调整，逐渐恢复，免疫功能逐渐降低到正常水平。

人体不仅仅是一个人的细胞构成的躯体，它也是一个由人的细胞和共生微生物细胞共同构成的复杂生物体。二者相互影响，共同作用于人体的免疫、营养、代谢和遗传等过程。人体自身免疫情况与肠道菌群关系极为密切。许多细菌产物能够作为免疫调节剂，调节控制人体的免疫系统[9]。一旦体外环境发生变化，肠道中正常的微生物群落的种群、活性就会发生异常或定位转移，出现菌群失调，可进一步引发宿主免疫功能出现改变，免疫功能紊乱或低下又会影响到菌群，也就是中医学所谓的邪正相争、消长进退、病情虚实转化的客观过程与关系[10]。

六淫邪气自外而来，多从肌表、口鼻侵袭人体，引起外感疾病。六淫致病初起多为表证，表证不除，由表及里，由浅入深传变。正如《素问·缪刺论》所说：“夫邪之客于形也，必先舍于皮毛；留而不去，入舍于孙脉；留而不去，入舍于络脉；留而不去，入舍于经脉；内连五脏，散于肠胃，阴阳俱感，五脏乃伤，此邪之从皮毛而入，极于五脏之次也。”六淫之湿邪来源于水的意象，与周围环境湿度增高有关。外湿所致疾病，从皮肤肌腠而浸入，内合脾脏，脾为湿土，湿必归脾而害脾，阻碍脾胃运化，津液不得运化传输，停聚而生湿邪，进而出现腹泻、皮疹、胸痹心痛等症状[11-15]。本研究通过人工调控湿度，对大鼠生存环境进行干预，观察大鼠空肠、回肠和结肠不同肠段的大肠杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌的数量变化，以探讨外湿对肠道菌群的影响。

研究结果发现，高湿度的时候，大鼠的空肠和结肠中大肠杆菌明显增多。大肠杆菌为条件致病菌，随着其数量的增多，就意味着疾病发生的可能性加大。外部环境影响内部环境，外部湿度加大使得肠道中的环境发生改变，更有利于大肠杆菌的繁殖，损害机体健康。不同湿度下，回肠中的大肠杆菌数量无明显变化，说明外部湿度改变对回肠影响不大。低湿度时候，空肠中的乳酸杆菌菌落数明显增多，而未在回肠、结肠这两个肠段发现这种现象。这可能是低湿度对空肠内部环境影响更大，更有利于乳酸杆菌的繁殖。在研究不同湿度对大鼠各个肠段中的双歧杆菌影响的时候，发现低湿度对大鼠空肠、回肠以及结肠中的双歧杆菌有明显的影响作用，双歧杆菌菌落数明显增多。这说明低湿度的环境更有利于整个肠段中的双歧杆菌的繁殖。乳酸杆菌和双歧杆菌作为益生菌的重要菌种，它们的增多表明生物机体的肠道功能非常健康，甚至可以说明整个的机体生理功能都很正常。本实验结果还发现，高湿度对结肠中双歧杆菌的菌落数亦有影响，其数量也有较为明显的增多。这可能是由于结肠对外界湿度改变所作出的反应造成的，具体机制尚有待进一步研究。

张六通等[16]研究发现，高湿组、高温高湿组及低温高湿组双歧杆菌数均明显低于正常对照组，但3组之间却无明显差异。进一步实验[17]发现，潮湿环境下，大鼠肠道双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌的数量都相对减少，大肠杆菌的数量却相对增加，其认为外湿致病不仅与潮湿气候环境有关，同时也与潮湿环境影响病原微生物的繁殖和传播有关。这些研究都与本研究结论相吻合，而本研究发现空肠对外湿影响更敏感，空肠的主要作用是消化和吸收，正好符合脾的运化功能。朱丹溪在《金匮钩玄·泄泻从湿治有多法》中记载：“得此证者，或因于内伤，或感于外邪，皆能动乎脾湿。脾病则升举之气下陷，湿变下注，并出大肠之道，以胃与大肠同乎阳明一经也”。空肠先受湿邪影响，而后湿邪下传影响到大肠，引起腹泻。

综上所述，外界湿度的改变对机体肠道内环境有明显的影响作用，改变了肠道菌群结构，从而导致疾病的产生。高湿度更有利于条件致病菌大肠杆菌的繁殖，不利于机体健康；低湿度更有利于益生菌乳酸杆菌和双歧杆菌的繁殖，有益于机体健康；而机体不同肠段对外界湿度改变的反应敏感度有所不同，空肠中3种菌的菌落数都有明显改变，说明空肠对外界湿度改变更为敏感。

参考文献：

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