薯蓣丸对慢性肾衰竭大鼠红细胞计数、血红蛋白及肾组织转化生长因子β 1的影响 ※

薯蓣丸对慢性肾衰竭大鼠红细胞计数、血红蛋白及肾组织转化生长因子β1的影响※

雷根平郭亚平1李小会曾小晴2王婷陈大威3

(陕西中医学院附属医院肾病一科，陕西咸阳712000)

※项目来源：陕西省二〇一二年科学技术研究发展计划(二)

(编号：2012JC2-09)

1陕西省榆林市中医医院肾病中心，陕西榆林719000

2陕西中医学院2011级硕士研究生，陕西咸阳712046

3陕西中医学院2013级硕士研究生，陕西咸阳712046

【摘要】目的观察薯蓣丸对慢性肾衰竭(CRF)大鼠红细胞计数(RBC)、血红蛋白(Hgb)含量及肾组织转化生长因子β1(TGF-β1)表达的影响。方法将70只雄性SD大鼠分为假手术组10只及手术组60只。手术组均采用5/6肾切除方法制备CRF模型，再随机分为3组即著蓣丸组(13只)、包醛氧淀粉组(14只)及模型组(13只)。薯蓣丸组以1.8 g/(kg·d)、包醛氧淀粉组以2 g/(kg·d)相应药液定时灌胃，假手术组及模型组每日同时间以等容积0.9%氯化钠注射液灌胃。6周后测大鼠血清RBC、Hgb含量，制作肾组织苏木精—伊红(HE)染色切片观察病变程度，免疫组化法测大鼠肾组织TGF-β1的表达情况。结果假手术组、薯蓣丸组及包醛氧淀粉组RBC、Hgb含量均高于模型组(P<0.05，P<0.01)，薯蓣丸组RBC、Hgb含量高于包醛氧淀粉组(P<0.05)。HE切片显示模型组病变程度明显，薯蓣丸组及包醛氧淀粉组病变程度较模型组均有所好转，薯蓣丸组病变轻于包醛氧淀粉组。假手术组、薯蓣丸组及包醛氧淀粉组肾组织TGF-β1阳性表达量低于模型组(P<0.05，P<0.01)，且薯蓣丸组低于包醛氧淀粉组(P<0.05)。结论薯蓣丸可升高CRF大鼠RBC及Hgb含量，降低大鼠肾组织TGF-β1水平，减轻肾脏病变。

【关键词】薯蓣丸；肾功能衰竭，慢性；大鼠；动物实验；红细胞；血红蛋白类；转化生长因子β1

doi：10.3969/j.issn.1002-2619.2015.06.025

作者简介：雷根平(1966—)，男，主任医师。研究方向：肾脏病的临床与实验研究。

【中图分类号】R692.5；R331.122；R446.112.4

【文献标识码】A

【文章编号】1002-2619(2015)06-0867-04

Abstract【】ObjectiveTo observe the effect of Shuyu pill on the contents of red blood cells (RBC)，hemoglobin(Hgb) and expression of nephridial tissue transforming growth factor beta 1(TGF-β1) in rats with chronic renal failure(CRF). Methods70 male SD rats were divided into sham operation group，model group，Shuyu pill group and oxyamyli tectus aldehydum group. CRF model in model group，Shuyu pill group and oxyamyli tectus aldehydum group were induced by 5/6 nephrectom. Rats in Shuyu group and oxyamyli tectus aldehydum group received 1.8 g/ (kg·d) and 2 g/ (kg·d) of Shuyu pill via gastrogavage respectively. The other rats received isasteric 0.9% sodium chloride injection by gastrogavage. After 6 weeks of experiment，the levels of RBC and Hgb were detected，pathological change of kidney-tissue by HE staining were observed，and expression of TGF-β1 were measured by immunohistochemistry. ResultsThe contents of RBC and Hgb in sham operation group，Shuyu pill group and oxyamyli tectus aldehydum group were higher than those in model group (P<0.05，P<0.01). The contents of RBC and Hgb in Shuyu pill group were higher than those in oxyamyli tectus aldehydum group (P<0.05). Pathological change of kidney-tissue was obvious in model group. Lesion extent in Shuyu pill group and oxyamyli tectus aldehydum group was less than that in model group. Positive expression quantity of TGF-β1 of nephridial tissue in sham operation group，Shuyu pill group and oxyamyli tectus aldehydum group were lower than those in model group (P<0.05，P<0.01). Pathological change of kidney-tissue and positive expression of TGF-β1 in Shuyu pill group were lower than those in oxyamyli tectus aldehydum group (P<0.05). ConclusionShuyu pill can enhance RBC and Hgb in rats with CRF，and decrease expression of TGF-β1 in kidney-tissue.

收稿日期：(2014-05-30)

Effects of Shuyu pill on erythrocyte，hemoglobin and nephridial tissue transforming growth factor beta 1 in rats with chronic renal failureLEIGenping*，GUOYaping，LIXiaohui，etal.*DepartmentofNephrologyOne，AffiliatedHospitalofShaanxiUniversityofChineseMedicine，Shaanxi，Xianyang712000

【Key words】Shuyu pill；Renal failure；Chronic；Rats；Animal experiment；Red blood cells；Hemoglobin；Transforming growth factor beta 1

慢性肾衰竭(chronic renal failure，CRF)是指各种原发或继发性肾脏疾病，不可逆转的使肾单位逐步丧失和肾功能持续损害，出现体内代谢潴留、水电解质紊乱、酸碱平衡失调，全身各系统逐渐受累为主要特征的临床症状综合征[1]，是临床疑难重症之一。CRF发病及进展机制复杂，其中细胞外基质(ECM)发挥着重要作用。转化生长因子-β1(TGF-β1)是目前为止发现的在纤维和结缔组织ECM发生、发展过程中最重要的细胞因子之一[2]。中医药在保护肾功能、延缓CRF进展方面有独特疗效。我们在临床治疗CRF过程中，以中医辨证论治为指导，结合多年临床心得，认为CRF的基本病机为本虚标实，并提出“慢性肾功能衰竭虚实相因”病机理论和“整体缓调，虚实同治”的治疗原则[3]，采用经方薯蓣丸治疗CRF患者，取得了很好的疗效[4]。本实验通过观察薯蓣丸对CRF模型大鼠红细胞计数(RBC)、血红蛋白(Hgb)含量及肾组织TGF-β1的影响，探讨其保护肾功能、延缓CRF进展的可能机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物健康SD雄性大鼠70只，9周龄，清洁级，体质量(200±10) g。均购自西安交通大学医学院实验动物中心，动物合格证号SCXK(陕)2012-003。

1.1.2药品与试剂薯蓣丸药物组成：山药30 g，当归、桂枝、神曲、生地黄、大豆黄卷各10 g，甘草28 g，人参、阿胶各7 g，川芎、白芍药、白术、麦门冬、杏仁、防风各6 g，柴胡、桔梗、茯苓各5 g，干姜3 g，白蔹2 g，大枣100枚。将上药研成细粉，由陕西中医学院附属医院药房制成浓缩丸，6 g/丸，溶入蒸馏水33 mL中制成混悬液，每mL含薯蓣丸0.18 g。包醛氧淀粉(5 g/袋，天津太平洋制药有限公司，国药准字H12021136)，溶入蒸馏水30 mL中制成混悬液，每mL含包醛氧淀粉0.20 g。TGF-β1试剂盒由迈凯雯生物科技(香港)有限公司提供。

1.1.3仪器QPJ-1B型生物病理旋转式切片机(天津爱华医疗器械有限公司)；HD-310型组织自动包埋机(湖北慧达仪器有限公司)；摊片烘片烤片机(PPTHK-21B型，上海精密仪器仪表有限公司)；FYL-YS-100L型恒温箱(北京福意电器有限公司)；DHG202-00A型实验室烤箱(上虞市道墟镇音花仪器厂)；CH-2型Olympus光学显微镜(日本奥林巴斯公司)；Image-Pro Plus 5.0型图像分析软件(美国Media Cybernetics公司)；XH-6020型免疫计数器(西安核仪器厂)；TD4K-Z型台式低速离心机(济南福的机械有限公司)；MYTHIC-22-AL型五分类血细胞分析仪(深圳市库贝尔生物科技有限公司)；BI-2000医学图像分析系统(成都泰盟科技公司)。

1.2实验方法

1.2.1造模及分组70只SD雄性大鼠适应性喂养1周后，随机分为2组。假手术组10只，手术组60只。手术组参照文献[5]的方法造模，术前禁食12 h，不禁水。腹腔注射10%水合氯醛(35~40 mg/100 g体质量)麻醉，分别剪除左肾上下各1/3左右皮质，复位残肾；1周后第2次手术，行右肾全切术。假手术组：先暴露左肾，不行手术切除，1周后行右肾暴露。手术组大鼠喂养5周，存活大大鼠(40只)，再随机分为3组：模型组(13只)、包醛氧淀粉组(14只)、薯蓣丸组(13只)。

1.2.2给药方法薯蓣丸组按临床成人用量6倍(20 g/kg)配制剂量浓度，1.8 g/(kg·d)灌胃，即10 mL，每日1次。包醛氧淀粉组均每日同时间予0.20 g/mL包醛氧淀粉悬混液，2 g/(kg·d)灌胃，即10 mL，每日1次；假手术组及模型组予等容积0.9%氯化钠注射液灌胃。共灌胃6周。

1.3观察指标及方法RBC、Hgb检测：灌胃6周后，将大鼠用10%水合氯醛(给药量为0.3~0.4 g/kg)腹腔注射麻醉，并行下腔静脉取血2 mL，装入抗凝管，反复颠倒数次使血与抗凝剂充分混匀，使用红细胞分析仪计数。肾组织病理切片：取血后打开腹腔，剖取左侧肾脏，以10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，留作病理检查标本，采用苏木精—伊红(HE)染色。HE染色步骤：①分别放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脱蜡各5 min；②分别按顺序放入无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各1 min；③蒸馏水冲洗1 min；④苏木素染色5 min；⑤流水冲洗1 min洗去多余苏木素；⑥1%盐酸-乙醇分化5 s后以蒸馏水迅速冲洗2 s，再以1%氨水返蓝5 s；⑦流水、蒸馏水各冲洗1 min后用0.5%伊红液染色1 min；⑧蒸馏水冲洗2 s，80%乙醇2 s；⑨分别置于95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ中各2 min；⑩分别按顺序放入无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ各3 min；中性树脂封片。后予光镜下观察肾脏组织病理变化。TGF-β1采用免疫组织化学法检测：应用病理图像分析系统进行图像采集和半定量分析，根据每张切片阳性反应颗粒的颜色深浅(黄色及棕褐色)及占细胞总数(面积)的比例来测量结果，为了方便计算与比较，视野内颗粒越多、颜色越深、面积越广，则阳性积分越高。

2结果

2.1大鼠死亡情况手术组从造模到分组开始，由于手术失败及术后感染，共死亡大鼠20只。其中第1次手术死亡12只，术后感染死亡4只；第2次手术死亡4只，术后感染死亡4只。剩余40只随机分为3组，模型组13只，薯蓣丸组13只，包氧淀粉组14只，从分组灌胃开始到实验结束，由于CRF及并发症，共死亡大鼠4只，其中模型组死亡1只，薯蓣丸组死亡1只，包醛氧淀粉组死亡2只。

2.24组大鼠RBC、Hgb比较见表1。

表1　4组大鼠RBC、Hgb比较

由表1可见，假手术组、薯蓣丸组及包醛氧淀粉组RBC、Hgb含量均高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。薯蓣丸组RBC、Hgb含量高于包醛氧淀粉组(P<0.05)。

2.34组大鼠肾组织病理改变HE切片显示，假手术组基本正常(见封3，图1)；模型组个别肾小球体积增大，少部分可见肾小球硬化、肾小管萎缩，系膜细胞与基质增多，肾间质纤维化伴炎性细胞浸润(见封3，图2)。薯蓣丸组及包醛淀粉组病变程度较模型组均有所好转，其中薯蓣丸组减轻明显(见封3，图3)，且优于包醛氧淀粉组(见封3，图4)。

2.44组大鼠肾组织TGF-β1表达情况见表2，封3(图5、6、7、8)。

表2　4组大鼠肾组织TGF-β 1表达情况

由表2可见，假手术组、薯蓣丸组及包醛氧淀粉组肾组织TGF-β1阳性表达量均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。薯蓣丸组TGF-β1阳性表达量低于包醛氧淀粉组(P<0.05)。

3讨论

5/6肾切除术是应用最广泛的CRF造模方法，该模型稳定有效，重复性好，能较好的模拟CRF的发病过程，因此我们采用5/6肾切除模型作为薯蓣丸研究CRF的模型。有研究显示，肾小球硬化、肾间质纤维化是终末期肾病(ESRD)的病理基础，ECM合成和降解系统失衡与肾小球硬化、肾间质纤维化密切相关[6]。TGF-β1是最重要的促ECM合成与积聚的因子之一，也是肾小球硬化的重要介质[7]。它在纤维化的发生中具有双重作用，正常表达时能发挥免疫功能，调节细胞的生长、分化并抑制炎症和细胞增生而起正面作用；而过度表达则可能导致组织纤维化。同时，TGF-β1被认为是基质金属蛋白酶和基质金属蛋白酶抑制物系统最重要的调控因子[8]。因此，对抗TGF-β1以阻止肾脏纤维化对治疗CRF具有重要意义，也成为一个公认的治疗靶点。RBC、Hgb是目前临床上最常用评价贫血的指标之一，CRF往往伴有肾性贫血。故本实验选用TGF-β1、RBC及Hgb作为观察指标。本研究结果显示，薯蓣丸及包醛氧淀粉均能升高CRF大鼠RBC、Hgb水平，降低肾组织TGF-β1的表达，减轻肾脏病理表现，其中薯蓣丸组作用更为明显。通过本实验可得出，薯蓣丸保护肾功能、延缓CRF进展，其可能机制为：①通过提升RBC、Hgb水平，改善肾脏病理状态；②抑制或降低TGF-β1在肾组织中过度表达，以抑制其致肾脏纤维化，减轻其肾小管—间质损害，延缓和防止肾小球进一步硬化，改善肾脏病变的进程。

我们认为，CRF的病机为“虚实相因”。所谓虚实相因，是指CRF的虚实病机互为因果，虚实混淆，循环反复，缠绵难愈[9]。正因为CRF存在病机上的“虚实相因”，具有病机的复杂性、病位的广泛性等特点，故治疗CRF应求助于复方、大复方来提高疗效，遵从“整体缓调，虚实同治”的治疗原则，选用经方薯蓣丸。该方组方特点为有7对药组组成，分别为山药、生地黄、麦门冬、蜂蜜构成滋阴补肾药组，人参、茯苓、大枣、白术、甘草构成健脾益气药组，白芍药、当归、阿胶、川芎构成养血活血药组，杏仁、桔梗构成宣肺药组，柴胡、大豆黄卷构成疏肝药组，桂枝、干姜构成温阳散寒药组，防风、桂枝构成祛风除湿药组。全方以培补脾肾、气血双补、滋阴温阳、养血活血、扶正祛邪为主，具有补阳不宜辛热、养阴不宜滋腻、活血不宜破血、祛风不宜开破、药量轻重有别、清热不宜苦寒、补益重在气血、守中兼顾四脏、补扶不忘流通等九大特点，对慢性复杂性疾病尤其是CRF具有深远的临床指导意义。

近年来中医药治疗肾组织纤维化已突显出明显的优势。本实验研究由于样本小，观察时间短等，存在一定不足，但本实验研究表明薯蓣丸对肾功能有一定保护作用，亦印证了肾组织中TGF-β1参与CRF的发生发展过程。总之具有培补脾肾、养血活血、扶正祛邪功效的薯蓣丸可以通过降低肾组织中TGF-β1及提高 RBC、Hgb水平，减轻肾脏病理改变，保护肾功能，延缓CRF进展，同时为中医药防治CRF提供了实验依据和理论基础。

参考文献

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[4]雷根平，杨晓航，董盛，等.加减薯蓣丸方治疗慢性肾功能衰竭240例临床观察[C]//中华中医药学会第二十一届全国中医肾病学术会议论文汇编(下).北京：中华中医药学会，2008：103-105.

[5]施新猷，顾为望.人类疾病动物模型[M].北京：人民卫生出版社，2008：206-207.

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[9]雷根平，刘玉霞，孙燕.慢性肾功能衰竭虚实相因病机特点与治疗思路[J].四川中医，2007，25(11)：28-29.

(本文编辑：李珊珊)