山杏仁蛋白源α－葡萄糖苷酶抑制肽的分离、纯化及鉴定

顾 欣 崔 洁 李 迪 王丰俊 王建中

山杏仁蛋白源α－葡萄糖苷酶抑制肽的分离、纯化及鉴定

顾 欣1，2崔 洁1，2李 迪3王丰俊1王建中1

（林业食品加工与安全北京市重点实验室北京林业大学1，北京 100083）
（北京林业大学自然保护区学院2，北京 100083）
（河北化工医药职业技术学院3，石家庄 050026）

针对木本油料山杏的蛋白质高值化利用问题，利用蛋白酶Alcalase酶解山杏仁蛋白，以体外α－葡萄糖苷酶抑制能力作为评价指标，筛选高活性α－葡萄糖苷酶抑制肽。山杏仁蛋白酶解液通过超滤、G－25葡聚糖凝胶柱、分子筛以及反相高效液相色谱的分离纯化，最终筛选得到2种高活性的α－葡萄糖苷酶抑制肽，其抑制能力分别为6.6μg／mL和7.0μg／mL。利用质谱和氨基酸测序仪对两种α－葡萄糖苷酶抑制肽的分子质量以及序列结构进行了研究，确认2种山杏仁蛋白源α－葡萄糖苷酶抑制肽分别为色氨酸－丙氨酸（WA）和苏氨酸－色氨酸（TW），其α－葡萄糖苷酶抑制能力的IC50值分别为23.97μmol／L和22.93μmol／L。

山杏仁多肽 α－葡萄糖苷酶抑制肽 分离 纯化 鉴定

糖尿病是以持续性高血糖为基本生化特征的一种机制复杂的疾病，是一种因体内胰岛素绝对或相对分泌不足而引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱的慢性全身性疾病［1］。随着人们生活方式的转变，糖尿病已成为仅次于肿瘤、心血管、脑血管疾病之后的严重威胁人类健康的慢性疾病之一［2］。治疗Ⅱ型糖尿病的药物也有很多种，其中主要有胰岛素促泌剂，双胍类，胰岛素分泌模式调节剂以及α－葡萄糖苷酶抑制剂［3］。α－葡萄糖苷酶的活性受到抑制，便能延缓α－糖苷酶将多糖分解为葡萄糖，从而减慢葡萄糖的吸收速度，起到降低餐后血糖水平的作用［4，5］。阿卡波糖这类人工合成的α－葡萄糖苷酶抑制剂在临床上会伴随一些副作用的发生，因此开发更多天然的、安全的α－葡萄糖苷酶抑制剂对Ⅱ 型糖尿病的治疗有着重大的意义［6］。

山杏是我国著名的木本油料，也是三北防护林的主要树种，广布于我国12个省市区。山杏仁营养丰富，富含蛋白质、脂肪、矿物质和维生素，其蛋白质含量、氨基酸总量、必需氨基酸总量高于一般坚果，有很高的经济价值和药用价值。山杏仁蛋白还具有抗肿瘤、降血压、降血糖、降胆固醇等功效［7－9］。研究人员成功从蚕丝蛋白中提取了三肽的α－葡萄糖苷酶抑制剂［10］。研究了山杏仁蛋白源α－葡萄糖苷酶抑制肽的分离筛选，对所得高活性α－葡萄糖苷酶抑制肽进行了结构分析，为II型糖尿病肽类治疗剂的开发提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

山杏仁：平泉亚欧杏仁有限公司；α－葡萄糖苷酶（Intestinal acetone powders from rat，10 G）、4 － 硝基苯－α－D－吡喃葡萄糖苷（PNPG，纯度＞99%）、1，1－二苯基－2－苦肼基（1，1，－dipheny1－2－picry－hydrazy，DPPH）：Sigma 公司；Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、Na2CO3、盐酸、无水乙醇：北京化工厂，均为分析纯试剂；乙腈、三氟乙酸、甲醇均为色谱纯试剂：北京拜尔迪生物技术有限公司；实验用水为去离子水。

1.1.2 材料与仪器

微孔滤膜（水系0.45μL，有机系0.22μL）：北京蓝弋化工产品有限公司；高效液相层析色谱分析仪：上海沪西仪器分析厂；PPSQ－31A全自动蛋白／多肽序列仪：日本Shimadzu Corporation；ÄKTA avant 25系统：日本；反相高效液相色谱：日本岛津。

1.2 试验方法

1.2.1 山杏仁蛋白的提取［11］

称取10 g脱脂山杏仁粉（过筛60目）溶于140 mL去离子水中，配制成溶液在细胞破碎仪下破碎10 min，使样品蛋白充分溶出。维持体系温度为37℃，pH 9.0，提取山杏仁蛋白60 min反应结束后，将浸提液在4 000 r／min条件下离心20 min，得到上清液调pH 至4.1，并在5 000 r／min 下离心15 min，收集沉淀，水洗沉淀调节其pH值至中性，迅速冷冻干燥得到山杏仁蛋白，并且在－20℃ 下贮藏以备用。

1.2.2 山杏仁蛋白酶解物制备

选取蛋白酶Alcalase 2.4 L FG（简称Alcalase）水解山杏仁蛋白，具体参数：料液比为50 g／L，加酶量为0.75%（体积比），pH值为9.0，水解温度为50℃，水解时间为6 h。

1.2.3 α－葡萄糖苷酶抑制活性的测定

样品对α－葡萄糖苷酶的抑制能力利用分光光度计法［12］，通过反应生成PNP的量来确定。一定浓度的样品中加入50μL 25 mg／mLα－葡萄糖苷酶溶液，50μL 0.913 3 mg／mL PNPG 溶液及120 μL 0.5 mol／L（pH 6.7）磷酸缓冲溶液。混匀后在37℃ 下保温60 min，加入0.67 mol／L Na2CO3溶液终止反应。空白组用去离子水替代样品溶液，背景组用磷酸缓冲液代替酶和底物。反应在405 nm下测定吸光值。计算公式：

式中：B为α－葡萄糖苷酶活性抑制率；A空为空白组的吸光度值；A样为样品组的吸光度值；A背为背景组的吸光度值。

1.2.4 α－葡萄糖苷酶抑制肽分离纯化

α－葡萄糖苷酶抑制肽分离纯化基本流程：

山杏仁蛋白Alcalase水解产物→超滤→凝胶层析→反相高效液相色谱→分子筛→第2次反相高效液相色谱→高纯度高活性的α－葡萄糖苷酶抑制肽。

1.2.4.1 超滤

山杏仁蛋白Alcalase水解产物在4℃条件下经不同分子质量大小的超滤膜（MWCO 30 000 u、10 000 u、5 000 u）获得具有不同分子质量的滤液，并测定各部分滤液的体外α－葡萄糖苷酶抑制活性。

1.2.4.2 Sephadex G－25 Medium凝胶层析分离

具有高α－葡萄糖苷酶抑制活性的组分经G－25葡聚糖凝胶色谱进行层析分离。流动相为：10 mmol／L Tris－HCl（pH 7.0）。色谱柱条件：Sephadex G25 Medium 柱（1.6 cm ×60 cm；Pharmacia，USA），流速为1 mL／min，整个设备系统在4℃ 下进行。洗脱峰在280 nm波长处进行检测并收集。

1.2.4.3 反相高效液相色谱分离

具有高α－葡萄糖苷酶抑制活性的组分经反向高校液相色谱柱分离。色谱柱为Zorbax SB－C18反相高效液相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）。流动相A（0.06%三氟乙酸的水溶液）为平衡缓冲液，流动相B（0.05%三氟乙酸的乙腈溶液）为洗脱缓冲液。分离纯化的洗脱梯度为流动相B（0%～50%）洗脱26 min，流动相A（50%～100%）洗脱4 min，洗脱峰在280 nm处进行检测并收集。

1.2.4.4 分子筛分离

分离出的高活性的组分经过ÄKTA avant 25系统分离。分子筛的柱子SuperdexTM Peptide 10／300 GL（10 mm ×300 mm）。平衡缓冲液为20 mmoL／L PBS 缓冲溶液（pH 7.0），流速0.5 mL／min，进样量为100μL洗脱梯度为等梯度2个柱体积，洗脱峰在280 nm处检测并收集。

1.2.4.5 反相高效液相色谱纯化

得到的高活性的山杏仁多肽冻干粉用反相高效液相色谱继续纯化，进一步得到高纯度高活性的α－葡萄糖苷酶抑制肽。具体的色谱条件及方法与反向色谱分离的操作步骤相同。

1.2.5 α－葡萄糖苷酶抑制肽质谱及氨基酸序列分析

分离纯化后的α－糖苷酶抑制肽的分子质量通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱进行检测，其氨基酸序列通过PPSQ－31A全自动蛋白／多肽序列仪测定。

2 结果与讨论

2.1 α－葡萄糖苷酶抑制肽分离纯化

蛋白质的水解程度与其生成肽链的长短有一定的关系，通常可以认为平均肽链长度＝1／水解度［13］。短肽容易以完整的形式被吸收进入人体代谢循环中，从而其生物活性较容易保持，本研究最终得到水解度为29.43%的山杏仁蛋白水解度，平均肽链长度为3.4，较易被人体吸收。

蛋白酶Alcalase酶解的山杏仁蛋白酶解液经过分子质量截留后，得到30 ku以上，30～10 ku，10～5 ku和5 ku以下4个不同分子质量的酶解液，分别测定其α－葡萄糖苷酶抑制活性。有研究表明蛋白水解物截留分子质量与其生物活性有一定的关系，超滤物的分子质量越小其抑制活性越高［14］。由图1可知，分子质量0～5 ku的组分α－葡萄糖苷酶抑制能力最强（0.42 mg／mL）。因此选取分子质量为0～5 ku Alcalase山杏仁蛋白酶解液继续分离质纯化。

图1 不同分子质量的酶解液的α－葡萄糖苷酶抑制活性

在分离纯化的过程中，利用多种分离手段相结合的方式，更容易将目的产物分离出来［15］。因此选用Sephadex G－25 Medium凝胶柱分离蛋白酶Alcalase酶解液0～5 ku组分，得到3个主要吸收峰：P1、P2和P3，具体结果见图2，分别测定其α－葡萄糖苷酶抑制活性。各色谱峰的α－葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值见图3，色谱峰P2对α－葡萄糖苷酶抑制抑制能力较高达到0.001 6 mg／mL，对该组分进一步的分离筛选。

图2 Alcalase酶解液0～5 ku组分Sephadex G－25凝胶层析色谱图

图3 Alcalase酶解液0～5 ku组分分离峰的α－葡萄糖苷酶抑制活性

蛋白酶Alcalase酶解液分离产物P2组分经反相C18柱分离得到P2P1、P2P2、P2P3、P2P4和P2P5五个主要组分（图4），分别测定各组分的α－葡萄糖苷酶抑制活性，其中组分P2P1α－葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值为0.007 1 mg／mL，组分P2P2α － 葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值为0.007 5 mg／mL，与另外3个组分相比有较高的α－葡萄糖苷酶抑制活性（见图5）。选用分子筛对组分P2P1、P2P2进一步分离纯化。

图4 蛋白酶Alcalase酶解液分离产物P2组分反相高效液相色谱图

图5 蛋白酶Alcalase酶解液分离产物P2组分分离峰的α－葡萄糖苷酶抑制活性

产物P2P1组分经过SuperdexTM Peptide 10／300 GL柱分离得到色谱图见图6，选取最大吸收峰b用反相高效液相色谱纯化高纯度组分B（图7），对B组分进行α－葡萄糖苷酶抑制活性测定，最终得到高纯度高活性的α－葡萄糖苷酶抑制肽B（IC50＝0.006 6 mg／mL）。

用与组分P2P1相同的分离方法来筛选蛋白酶Alcalase酶解液分离产物P2P2组分得到分子筛色谱图（图8），选取主峰d进行纯化得到高纯度高活性的α－葡萄糖苷酶抑制肽D（图9），其α－葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值为0.007 0 mg／mL。所得2种α－葡萄糖苷酶抑制肽比市售降糖药拜糖平（IC50为0.010 8 mg／mL）的α －葡萄糖苷酶抑制能力更强［16］。

图6 蛋白酶Alcalase酶解液分离产物P2P1组分分子筛色谱图

图7 蛋白酶Alcalase酶解液分离产物b分离峰的高效液相色谱纯化色谱图

图8 蛋白酶Alcalase酶解液分离产物P2P2组分分子筛色谱图

图9 蛋白酶Alcalase酶解液分离产物d分离峰的高效液相色谱纯化色谱图

2.2 α－葡萄糖苷酶抑制肽结构

2.2.1 α－葡萄糖苷酶抑制肽B

纯化后获得的高活性的山杏仁蛋白源α－葡萄糖苷酶抑制肽B的质谱结果如图10所示，预测其分子质量为：275.4 g／mol。经过N－端氨基酸序列分析，B的氨基酸序列为色氨酸－丙氨酸（Trp－Ala），实际分子质量为275.31 g／mol。

2.2.2 α－葡萄糖苷酶抑制肽D

纯化后获得的高活性的山杏仁蛋白源α－葡萄糖苷酶抑制肽D的质谱结果如图11所示，测定其分子质量为306.3 u。经过N－端氨基酸序列分析，D的氨基酸序列为苏氨酸－色氨酸（Thr－Trp），实际分子质量为305.34 u。

图10 蛋白酶Alcalase酶解肽（B）质谱分析图

图11 蛋白酶Alcalase酶解肽（D）质谱分析图

3 结论

利用酶解、分子质量截留、分子筛、反相高效液相色谱等技术，对山杏仁蛋白酶解液进行分离纯化，得到两种α－葡萄糖苷酶抑制肽，并对其进行质谱分析和氨基酸序列分析，最终得到的山杏仁蛋白源α－葡萄糖苷酶抑制肽分别为色氨酸－丙氨酸（WA）和苏氨酸－色氨酸（TW），两者的α－葡萄糖苷酶抑制能力的IC50值分别为23.97 μmol／L 和22.93 μmol／L，其α－葡萄糖苷酶抑制能力优于市售药物拜糖平。这不仅为血糖的控制提供了一个良好的植物蛋白来源，而且提高了山杏仁蛋白在产业中的利用价值。对于已知结构的多肽可以利用合成的方法提高其产量，应用于如降糖的动物实验或者其他生物活性的研究。

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Separation，Purification，and Identification ofα － Glucosidase Inhibitory Peptides from Apricot Kernel Proteins

Gu Xin1，2Cui Jie1，2Li Di3Wang Fengjun1Wang Jianzhong1
（Beijing Key Laboratory of Forest Processing and Safety Beijing Forestry University1，Beijing 100083）
（School of Natural Preservation Area，Beijing Forestry University2，Beijing 100083）
（Hebei Chemical＆ Pharmaceutical College3，Shijiazhuang 050026）

Apricot kernel proteins was hydrolyzed by Alcalase to solve the problem of high－value utilization of woody oil apricot kernel，using in vitroα －glucosidase inhibiting ability as the evaluation index to screen high－activityα－glucosidase peptide inhibitors.Two kinds of high－activityα－glucosidase peptide inhibitors were isolated and purified from apricot kernel protein hydrolyzates via ultrafiltration，Sephadex G －25，molecular sieve，and reversed phase high－performance liquid chromatography.The inhibition of the AGA inhibitory peptides was 6.6 μg／mL and 7.0 μg／mL，respectively.The molecular structure and sequences of the AGA inhibitory peptides were identified through mass spectrometry and amino acid sequencing.The AGA inhibitory peptides from the apricot kernel hydrolyzate were identified as WA and TW.The median inhibitory concentration of WA was 23.97 μmol／L and that of TW was 22.93 μmol／L.

apricot kernel polypeptides，AGA inhibitory peptides，separation，purification，identification

TS201.2

A

1003－0174（2016）08－0116－06

林业公益性行业科研专项（201004081）

2014－12－05

顾欣，女，1983年出生，博士，生物资源利用与天然产物开发

王建中，男，1952年出生，教授，生物资源利用与天然产物开发