大豆皮天冬氨酸蛋白酶的提取、纯化与鉴定

刘 春 程芬芬 马洪雨 王金梅 侯俊杰 杨晓泉

大豆皮天冬氨酸蛋白酶的提取、纯化与鉴定

刘 春1程芬芬1马洪雨2王金梅1侯俊杰1杨晓泉1

（华南理工大学轻工与食品学院食物蛋白工程研究中心，淀粉与植物蛋白深加工教育部工程研究中心1，广州 510641）
（南京农业大学植物保护学院2，南京 210095）

从大豆加工副产物——大豆皮的高值化利用出发，以大豆皮为原料，在纤维素酶辅助提取大豆皮蛋白质的基础上，利用CM－Sepharose柱离子交换层析纯化大豆皮蛋白粗提物，用SDS－PAGE分辨大豆皮蛋白粗提物和纯化后的蛋白质，对电泳凝胶分辨出来的蛋白条带用基质辅助激光解析电离飞行时间二级质谱（MALDI－TOF－TOF MS）进行鉴定，并测定了其在pH 2～6范围内的酶活性，结果表明首次从大豆皮中纯化鉴定出类猪笼草蛋白酶I大豆天冬氨酸蛋白酶，得率为233 mg／kg，纯化后的类猪笼草蛋白酶I大豆天冬氨酸蛋白酶在pH 3时对血红蛋白的比活力最高，为62.1 U／mg。

类猪笼草蛋白酶I大豆皮天冬氨酸蛋白酶 提取 纯化 鉴定 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱

天冬氨酸蛋白酶（aspartic proteases，EC 3.4.23）是一类在酸性pH下有活性的蛋白水解酶，广泛分布于真核生物以及微生物中［1］。根据MEROPS数据库（http：／／www.merops.ac.uk）数据［2］，目前基于氨基酸序列同源性天冬氨酸蛋白酶被分为14个不同的家族，基于其进化关系和三级结构进而组合成6个不同的大类。大多数植物天冬氨酸蛋白酶属于A1家族。该家族蛋白酶拥有较高的序列相似性和以C2为对称轴的2个双叶型三级结构。典型的天冬氨酸肽链内切酶在其活性中心包含2个天冬氨酸残基，该催化残基位于保守区Asp －Thr／Ser－Gly（DT／SG）基序内并形成酶活性位点［3］。天冬氨酸蛋白酶的主要功能是降解蛋白、抗原和促进其他酶的活化等［1］。

一些天冬氨酸蛋白酶在植物的各种组织中均可表达，如水稻［4］、拟南芥［5］；有些天冬氨酸蛋白酶具有组织表达特异性，有的只在干种子和豆荚中表达，有的只在花和豆荚中表达，不同组织的特异性表达可能与其生理功能不同有关［3］。2004年，大豆天冬氨酸蛋白酶soyAP1和soyAP2的cDNA被克隆，Northern分析表明，soyAP2在除种子以外的根、茎、叶、花等各种组织中均可表达，而soyAP1只在种子中特异性表达［6］，暗示其启动子很可能是种子特异性启动子。

大豆皮约占整个大豆种子质量的8%［7］。近年来，随着大豆脱皮制油和脱皮生产大豆分离蛋白工艺的普遍应用，产生了大量的副产物大豆皮。目前，大豆皮主要用做饲料，综合利用度低。为提高大豆皮的综合利用度，人们已经开展了从大豆皮中提取膳食纤维和有效成分的研究，大豆皮约含9.56%的蛋白质［8］，从1969 年Buzzll等［9］发现大豆皮过氧化物酶开始，迄今已从大豆皮中提取纯化到过氧化物酶［10］，Bowman － Birk 型蛋白酶抑制剂［11］和几丁质酶I［12］等生物活性蛋白质，其中大豆皮过氧化物酶在食品添加剂［13］、生物传感器［14］和环保方面［15］已有比较广泛的应用。

虽然已有植物天冬氨酸蛋白酶及其可能功能的相关报道，但对于大豆天冬氨酸蛋白酶人们知之甚少，而大豆是人们一种重要的食品蛋白质资源。据报道大豆天冬氨酸蛋白酶在胚轴和子叶中均有存在［16］，但迄今鲜见其分子实体和功能的相关信息。因此，本研究从大豆加工副产物——大豆皮高值化利用的角度出发，在纤维素酶辅助提取大豆皮蛋白质的基础上，通过离子交换层析纯化大豆皮蛋白粗提物，用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI－TOF－MS）进行鉴定，并测定了其在各种pH下的酶活性。以期为医药保健和食品加工提供原料天然，来源广泛、成本低廉、工艺易于规模化放大的目标产品。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆皮粉：山东香驰控股集团；Viscozyme L复合植物水解酶：丹麦Novozymes公司；标准分子质量蛋白、血红蛋白：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；测序级改性胰蛋白酶：美国Promega公司；其他化学试剂均为分析纯。

Labor Pilot 2000／4胶体磨：德国IKA公司；F－70薄膜闪蒸仪：日本Tokyo Rikakikai公司；AKTA纯化系统：美国GE公司；DELTA 1－24 LSC冷冻干燥机：德国Christ公司；KjelFlex K－360凯氏定氮仪：瑞士Buchi公司；PROTEAN Tetra电泳系统：美国BIORAD公司；4800 Plus MALDI－TOF－TOFTM分析仪：美国Applied Biosystems公司；GENESYS 10S UVVis分光光度计：美国Thermo公司；Millipore纯水系统：法国Millipore公司。

1.2 试验方法

1.2.1 大豆皮天冬氨酸蛋白酶的提取

100 g大豆皮粉加40倍体积0.2 mol／L CaCl2溶液，用胶体磨剪切30 min，在温度40℃，pH＝4.5条件下按3.02 FBG／g加入Viscozyme L复合植物水解酶，提取6 h后，以8 000 r／min的速度离心10 min除去沉淀，上清液在40℃下用F－70薄膜闪蒸仪浓缩，浓缩液加100% 三氯乙酸（TCA）至终浓度10%，在4℃下放置30 min；然后以8 000 r／min的速度离心30 min，去掉上清，将沉淀再悬浮于适量的0.1 mol／L NaOH溶液中，涡旋混匀后的蛋白提取物溶液对Millipore纯水（15 MΩ）透析3 d，然后用Alphal－4冷冻干燥机干燥。

1.2.2 蛋白质含量分析

微量凯氏定氮法（N×6.25）。

1.2.3 CM－Sepharose柱层析

经透析的浓度约1 mg／mL的粗蛋白液20 mL上CM－Sepharose柱，CM－Sepharose柱首先用25 mmol／L Tris－HCl（pH ＝8.0）缓冲液平衡。洗脱程序：首先用100 mL 25 mmol／L 的Tris－ HCl（pH ＝8.0）缓冲液洗脱未交换上的蛋白质；然后用200 mL pH 8.0的Tris－HCl缓冲液与等体积含0.4 mol／L NaCl的Tris－HCl缓冲液进行梯度洗脱结合上的蛋白质；最后用1 mol／L的NaOH溶液进行洗脱。洗脱流速30 mL／h，每5 mL（10 min）收集1 管。测定每管洗脱液的A280nm值。对有吸光值的洗脱液以血红蛋白为底物进行酶活力测定。合并有酶活性的洗脱液，对超纯水（18.2 MΩ）透析1 d，浓缩，冷冻干燥。

1.2.4 SDS－PAGE

按Laemmli［17］的方法。采用不连续垂直板状凝胶电泳，凝胶厚度1 mm，浓缩胶浓度为5%，电流15 mA，分离胶浓度为12%，电流30 mA。用考马斯亮蓝R －250（0.05%，m／V）染色2 h，用蒸馏水漂洗2 ～3次，再用甲醇、冰醋酸溶液（甲醇∶冰醋酸∶水＝1∶1∶8，V／V／V）在脱色摇床上脱色，直至各亚基条带清晰。电泳凝胶用Bio－Rad公司的Quantity－one软件分析。

1.2.5 MALDI－TOF－TOF MS

通过胶内酶解和基质辅助激光解析电离飞行时间二级质谱（MALDI－TOF－TOF MS）鉴定蛋白质。从聚丙烯电泳凝胶中手动切取蛋白条带，用Millipore纯水洗3次，在含50 mmol／L NH4HCO350%的乙腈中对考马斯亮蓝染色的蛋白条带脱色2次，在含10 mmol／L DTT 的50 mmol／L NH4HCO3溶液中进行还原，在含40 mmol／L 碘乙酰胺的50 mmol／L NH4HCO3溶液中烷基化，用100%乙腈干燥2次，然后在37℃下在含测序级改性胰蛋白酶的50 mmol／L NH4HCO3溶液中消化过夜。消化后的多肽用含0.1%三氟乙酸（TFA）的50%的乙腈提取2次。合并提取液并冻干。得到的胰蛋白酶酶解的多肽冻干粉溶解含0.1%TFA和50% 乙腈的5 mg／mL CHCA基质中。用4800 Plus MALDI－TOF－TOFTM分析仪进行MALDI－TOF－TOF MS分析。

利用在线MASCOT 程序（http：／／www.matrixscience.com）对所有蛋白质质谱数据在NCBInr数据库中进行搜索。搜索参数：允许最大的肽质量误差为0.15 u，允许最大的TOF－TOF片段质量误差为0.25 u，允许最大的未被酶切位点数为1，固定修饰为脲甲基半胱氨酸［Carbamidomethyl（C）］，可变修饰为氧化甲硫氨酸［（Oxidation（M）］。只有被MASCOT概率分析定义为显著的hits（P＜0.05）才被接受。

1.2.6 大豆皮天冬氨酸蛋白酶活力的测定

按Barret等［18］方法测定不同pH值下的酶活力：取溶于各种pH值缓冲液中的1%（m／V）血红蛋白溶液200μL与溶于相同pH值缓冲液中的50μL酶液混合，37 ℃孵育30 min。加入250 μL 10%（m／V）冰三氯乙酸（TCA）溶液终止反应。反应混合物静置20 min 后以10 000 r／min 离心10 min，用GENESYS10S UV－Vis分光光度计在280 nm检测上清中的多肽。酶活力单位采用国际单位（IU，又称U），1个国际单位为在特定条件下（如37℃，pH＝3），1 min内转化1μmol底物，或者底物中1μmol有关基团所需的酶量。

2 结果与讨论

2.1 大豆皮蛋白粗提物和纯化后样品的得率与酶活力

大豆皮蛋白粗提物和纯化后样品的得率与酶活力见表1。用本方法提取到的大豆皮蛋白粗品得率约为1.21%，利用凯氏定氮法测得粗提物中蛋白质含量为55.19%，因此粗提物中总蛋白量为667.8 mg，因大豆皮原料的质量为100 g，因此，粗提物中蛋白质的得率为0.67%。过CM－Sepharose层析柱纯化后，将有酶活性的洗脱部分冻干后得到23.3 mg的样品，纯化后的蛋白质得率约为0.02%，即233 mg／kg。虽然大豆皮约含9.56%的蛋白质，但大部分是与纤维素、半纤维素和果胶等细胞壁成分共价结合的结构蛋白，如伸展蛋白、富甘氨酸蛋白等，这些共价结合的结构蛋白在成熟的次生细胞壁中是不能够被提取的，而像细胞质中的天冬氨酸蛋白酶这一类生物活性蛋白质本身含量很少，因此，这些活性蛋白的得率很低。对粗提物和纯化后的蛋白按Barret和Heath的方法测定酶的活力，粗提物对血红蛋白的比活性为3.45 U／mg，纯化后的样品比活性为62.1 U／mg。这些比活力结果分别与Athauda等［19］报道的猪笼草天冬氨酸蛋白酶1在原液中和DEAE－52柱层析纯化后的比活力相近。

表1 大豆皮蛋白粗提物和纯化后样品的得率和比活力

2.2 大豆皮蛋白粗提物和纯化后蛋白的SDSPAGE

大豆皮蛋白粗提物和纯化后蛋白的SDS－PAGE见图2。大豆皮蛋白粗提物在分子质量约50 ku处有一细蛋白条带（图1蛋白条带A），在分子质量为18 ku附近有一粗条带，在分子质量为10 ku附近有一些弱的条带。经Bio－Rad凝胶分析软件Quantityone分析表明，蛋白条带A占整个泳道光密度值的5%，大豆皮蛋白粗提物经CM－Sepharose层析柱纯化后，有酶活性的洗脱部分的电泳图谱如图1泳道2，该泳道只在分子质量约50 ku处有1条清晰的蛋白条带（图1蛋白条带B）。

图1 大豆皮蛋白粗提物和纯化后蛋白的SDS－PAGE图谱

2.3 大豆皮天冬氨酸蛋白酶的鉴定

对大豆皮蛋白粗提物和纯化后蛋白的SDSPAGE凝胶中的蛋白条带进行了切胶鉴定。经胶内酶解、MALDI－TOF－MS分析获得其肽质量指纹谱（peptide mass fingerprinting，PMF）如图2，从图1 蛋白条带A中鉴定出4个达显著值（P＜0.05）的肽段（表2），从图1蛋白条带B中鉴定出5个达显著值（P＜0.05）的肽段（表3），然后对PMF进行二级质谱分析（表2～表3）。由于纯化后的蛋白样品（图1蛋白条带B）的纯度提高，所以蛋白质鉴定的Mowse得分比粗提物中该蛋白的得分高（表4），且2个蛋白条带（图1蛋白条带A和B）的Mowse得分均显著高于可接受得分阈值（55分）。因此，这2个蛋白条带均被鉴定为类猪笼草蛋白酶1大豆天冬氨酸蛋白酶（aspartic proteinase nepenthesin －1 －like［Glycine max］）。从而确定试验分离纯化到的蛋白质是类猪笼草蛋白酶1大豆天冬氨酸蛋白酶。而大豆皮蛋白粗提物SDS－PAGE电泳凝胶的三条蛋白条带中，只有蛋白条带A（图1）被鉴定为类猪笼草蛋白酶1大豆天冬氨酸蛋白酶，而在分子质量为18 ku附近的粗条带和在分子质量为10 ku附近的弱条带均无可接受的质谱鉴定结果（数据未列出）。

猪笼草蛋白酶（Nepenthesin），又称猪笼草酸性蛋白酶（Nepenthacin）、猪笼草天冬氨酸蛋白酶（Nepenthasin），它是猪笼草（Nepenthessp．）捕虫笼及盾叶毛膏菜（Drosera peltata）分泌的天冬氨酸蛋白酶。其与胃蛋白酶类似，但其也能酶切两侧的天冬氨酸残基及赖氨酸和精氨酸。其对pH值及温度的稳定性高于猪胃蛋白酶A［20］。在猪笼草属中已确定了2个同工酶［19，21］：猪笼草蛋白酶1（nepenthesin － 1）和猪笼草蛋白酶2（nepenthesin－2）。这2个同工酶富含半胱氨酸残基（12个半胱氨酸残基／分子），分子建模表明这12个半胱氨酸残基可形成6个分子内二硫键，这也是猪笼草蛋白酶具有非凡稳定性的原因。被鉴定出的类猪笼草蛋白酶1大豆天冬氨酸蛋白酶前体有451个氨基酸残基，这一鉴定结果是根据质谱数据从大豆基因组序列（NW＿003722732.1）自动计算分析获得的，该基因组数据由Gnomon基因预测方法注释并受mRNA和EST数据的支持。因此，本研究首次从大豆皮中获得了该基因序列编码的蛋白质分子实体。通过在线信号肽预测软件SignalP－4.1［22］（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）分析（数据未列出），其N端起始的前34个氨基酸残基为信号肽，成熟分子含有13个半胱氨酸残基，与猪笼草蛋白酶1等植物天冬氨酸蛋白酶和猪胃蛋白酶等动物天冬氨酸蛋白酶均具有序列同源性。

图2 图1中蛋白条带A（a）和B（b）的肽质量指纹谱

2.4 大豆皮天冬氨酸蛋白酶的酶活力测定

大豆皮天冬氨酸蛋白酶在不同pH值下的相对活力见图3。以血红蛋白为底物的最佳酶活力出现在pH3（比活力为62.1 U／mg），将此比活力值定为1，其他pH值下的比活力与pH3下的比活力相比得到相对活力。从图3看出，当pH值从3增加到3.5时，其相对活力迅速下降到46%，当pH值继续增加时，其相对活力继续下降，当pH值为6时，其相对活力下降到只有8%。而当pH值从3下降时，相对活力下降较缓，当pH值为2时，其相对活性仍有57%。这说明类猪笼草蛋白酶1大豆天冬氨酸蛋白酶具有天冬氨酸蛋白酶家族在酸性pH下有活性的典型特征。

表2 通过二级质谱从图1蛋白条带A中鉴定出的肽段

表3 通过二级质谱从图1蛋白条带B中鉴定出的肽段

表4 图1中蛋白条带A和B的二级质谱鉴定结果

图3 类猪笼草蛋白酶1大豆天冬氨酸蛋白酶在不同pH值下的相对活力

3 结论

从大豆加工副产物——大豆皮中纯化获得类猪笼草蛋白酶1大豆天冬氨酸蛋白酶，并利用基质辅助激光解析电离飞行时间二级质谱（MALDI－TOFTOF MS）进行了鉴定。其得率为233 mg／kg。该酶具有天冬氨酸蛋白酶家族在酸性pH下有活性的典型特征，在最适pH条件——pH 3时，类猪笼草蛋白酶1大豆天冬氨酸蛋白酶对血红蛋白的比活力为62.1 U／mg。

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Extraction，Purification and Identification of Aspartic Proteinase from Soy Hulls

Liu Chun1Cheng Fenfen1Ma Hongyu2Wang Jinmei1Hou Junjie1Yang Xiaoquan1
（Research and Development Center of Food Proteins，College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Engineering Research Center of Starch and Vegetable Protein Processing Ministry of Education1，Guangzhou 510641）
（College of Plant Protection，Nanjing Agricultural University2，Nanjing 210095）

Soy hull，a co － product of soybean processing，was investigated as a source of aspartic proteinase.Crude soy hull proteins were isolated from soy hulls by a cellulase－assisted extraction method，further purified via ion exchange chromatography with CM－Sepharose Fast Flow column.The crude protein and purified protein were identified by SDS－PAGE.The separated protein bands in SDS－PAGE were cut and identified using matrix－assisted laser desorption ／ionization time－of－flight／time－of－flight mass spectrometry（MALDI－TOF－TOF MS），the enzymatic activity of the identified protein was determined in the range of pH 2～6.The results indicated that we firstly purified a soybean aspartic proteinase nepenthesin－1 －like from soy hulls，the yield of purified aspartic proteinase was 233 mg／kg，and the specific activity of soybean aspartic proteinase nepenthesin －1 － like reached to the peak value at pH 3，62.1 U／mg.

aspartic proteinase nepenthesin － 1 － like ［Glycine max］，extraction，purification，identification，MALDI－TOF－MS

TS253.1

A

1003－0174（2016）08－0111－06

863计划（2013AA102208－3），公益性行业（农业）科研专项（201303071），粮食公益性行业科研专项（201313005）

2014－12－30

刘春，男，1978年出生，博士，蛋白质化学与工程

杨晓泉，男，1965年出生，教授，蛋白质化学与工程