重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail 联合吉西他滨诱导胰腺癌细胞凋亡的实验研究

陈培生，邓三花，王伟飞，何锋坚，何 琼，岳 辉

南方医科大学第三附属医院消化内科，广东 广州510630

胰腺癌是消化系统高度恶性的肿瘤，严重威胁着人类的健康，其发病率呈逐年上升趋势，胰腺癌早期诊断困难，手术切除率低，近90%的患者在确诊胰腺癌后1 年内死亡，而5 年生存率不足5%，是消化系统肿瘤中预后最差，有“癌中之王”之称［1-2］。由于传统的治疗方法有其自身的局限性，因此，寻找胰腺癌的新治疗方法成为当务之急。本研究利用能特异诱导肿瘤细胞凋亡的重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trai 及胰腺癌化疗中的金标准化疗药-吉西他滨，观察两者联合作用诱导胰腺癌细胞凋亡的情况。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及抗体 质粒小量提取试剂盒、Lipofectmine-LTX 转染试剂盒(Invitrogen);小牛血清(四季清公司);兔抗Trail 单克隆抗体(CST);辣根过氧化酶标记山羊抗兔二抗(中杉金桥公司);吉西他滨(江苏豪森药业股份有限公司，纯度99%以上)。

1.2 菌种与质粒 大肠杆菌TOP10 感受态细胞(天根公司);重组真核表达质粒pcDNA3.1/SurP/Trail(含有Survivin340 启动子序列及全长Trail cDNA 序列)由本实验室保存。

1.3 细胞 SW1990 胰腺癌细胞由本实验室保存。用10%灭活小牛血清的新鲜RPMI 1640 培养，37 ℃、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养。

1.4 脂质体转染及Western blotting 检测 用lipofectamine-LTX 转染试剂盒将重组质粒pcDNA3. 1/SurP/Trail 导入SW1990 胰腺癌细胞中。转染72 h 后检测各组细胞中Trail 表达的情况，将上清液、纯化后的蛋白和蛋白标准样品进行SDS-PAGE 电泳，用Western blotting Chemiluminescence 试剂盒检测各组细胞Trail 的表达。

1.5 双标记流式细胞术分析细胞凋亡 将SW1990胰腺癌细胞分为4 组，联合组:转染pcDNA3.1/SurP/Trail 重组质粒并加入20 μmol/L 吉西他滨;重组质粒组:转染重组质粒;吉西他滨组:加入20 μmol/L 吉西他滨;空白对照组:未加任何处理。处理48 h 后收集各组细胞，参照Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒提供方法，处理细胞后用双标记流式细胞术分析各组细胞的凋亡率。

1.6 统计学分析 采用SPSS 13.0 软件进行统计分析，结果用s 表示，组间多重比较采用Bonferroni 方法分析，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Western blotting 检测Trail 在各组SW1990 胰腺癌细胞的表达 重组质粒组及联合组均有Trail 蛋白表达，吉西他滨组和空白对照组则无Trail 蛋白表达(见图1)，说明SW1990 胰腺癌细胞转染重组质粒后能特异性表达Trail 蛋白。

图1 Western blotting 检测Trail 蛋白表达的情况 1:联合组;2:重组质粒组;3:吉西他滨组;4:空白对照组Fig 1 Trail protein expression in four group by Western blotting cells 1:the combination group;2:the recombinant plasmid group;3:the gemcitabine group;4:the control group

2.2 双标记流式细胞术分析各组SW1990 胰腺癌细胞的凋亡率 经处理后，联合组、重组质粒组、吉西他滨组、空白对照组SW1990 胰腺癌细胞的凋亡率(%)分别为10.59±0.64、5.05 ±0.50、4.95 ±0.51、2.67 ±0.34。联合组的SW1990 胰腺癌细胞凋亡率明显高于其他组，差异有统计学意义(P ＜0.05);重组质粒组与吉西他滨组的细胞调亡率相比，差异无统计学意义(P ＞0.05);重组质粒组和吉西他滨组与空白对照组比较，细胞凋亡率明显升高，差异有统计学意义(P ＜0.05)。

3 讨论

近些年来，随着分子生物学及分子生物技术的快速发展，基因治疗逐渐成为近几年研究的热点，尤其是肿瘤的基因治疗已成为肿瘤生物治疗研究的热点，靶向性是基因治疗中有待解决的难点，因此，选择能在肿瘤细胞中特异表达的杀伤基因成为基因治疗的关键。肿瘤杀伤基因的靶向性表达原理是将具有肿瘤特异性的启动子序列与肿瘤杀伤基因相偶联，使带有启动子的肿瘤杀伤基因只在肿瘤细胞中表达，从而减轻对正常组织的损伤。

Survivin 启动子可用作肿瘤靶向治疗的工具，启动下游杀伤基因特异性表达于肿瘤细胞，从而避免损伤正常细胞。研究已证实Survivin 启动子在肿瘤细胞中的活性超过了分子生物学实验中常用的高活性工具启动子—病毒SV40 启动子的2 ～3 倍［3］。许多研究已证实Trail 蛋白具有杀伤肿瘤细胞的特异性［4］，其与受体DR4 和DR5 结合可诱导细胞凋亡，而Ozawa 等［5］研究发现，胰腺癌组织中DR4 和DR5 的mRNA 水平明显高于正常胰腺组织的表达［6］，Tan 等［7］也发现5种胰腺癌细胞株高水平表达诱导凋亡的DR4 和DR5。吉西他滨是近年研制的新型嘧啶类似物，它的出现使胰腺癌的化疗取得了突破性的进展，Oettle 等［8］进行了一项对比吉西他滨和5-Fu 的Ⅲ期临床研究，结果显示，吉西他滨单药化疗在临床获益和生存期方面，明显优于传统的5-Fu。因此，吉西他滨被美国FDA 批准为胰腺癌治疗中的金标准化疗药［9-10］。

本研究中，我们将能特异性诱导肿瘤细胞凋亡的重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail 及吉西他滨联合，并共同作用于胰腺癌细胞，通过研究结果显示，联合组、重组质粒组及吉西他滨组SW1990 细胞均出现凋亡，且联合组凋亡率均显著高于其他两组。提示重组质粒pcDNA3.1/SurP/Trail 与吉西他滨联合具有协同作用，并能更有效促进SW1990 胰腺癌细胞的凋亡。

但是，本研究在深度及广度上还需继续改善，并计划进一步在胰腺癌的裸鼠模型中评价其安全性和有效性。

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