脂联素在重症急性胰腺炎脂肪组织中的表达及意义

韩超群，杨 芬，刘 俊，钱 伟，丁 震

华中科技大学同济医学院附属协和医院消化内科，湖北 武汉430022

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是临床上常见危重症，其病情发展迅速，早期即可出现多器官功能障碍综合征(MODS)，死亡率高达20% ～30%［1］。肥胖不仅作为急性胰腺炎的独立危险因素，它同时还增加急性胰腺炎的死亡率［2］，但其机制尚未完全清楚，脂肪组织作为储脂器官，同时也分泌一系列脂肪因子和细胞因子，本研究主要探讨脂肪细胞因子脂联素(diponectin)及部分炎症因子在SAP 脂肪组织中的表达、作用及可能的意义。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂 12 只SD 雄性大鼠购自华中科技大学同济医学院动物中心，牛磺胆酸钠购自ACROS ORGANICS，Trizol 购自invitrogen 公司，反转录试剂盒购自TaKaRa 公司，聚合酶链式反应PCR 扩增试剂盒购自QIAGEN 公司。

1.2 分组及模型制备 12 只SD 大鼠体质量240 ～350 g，平均体质量290 g，称重编号后随机分为2 组:假手术对照组(N 组)、SAP 组，每组6 只。实验前SD大鼠禁食不禁水，SAP 组采用1%戊巴比妥钠4 ml/kg腹腔麻醉、开腹，胰胆管推注5% 牛黄胆酸钠1 ml/kg制成SAP 模型，N 组SD 大鼠开腹后不经胰胆管推注5%牛黄胆酸钠，仅翻动十二指肠及胰腺组织数次后关腹。2 组分别于24 h 内处死取附睾旁脂肪组织。

1.3 脂肪组织内脂联素、IL-10、TGF-β1、TNF-α 表达的检测 用Trizol 提取脂肪细胞内的RNA(将混有Trizol 的脂肪组织研磨均匀放置5 min 并4 ℃、12 000 r/min 15 min 离心后EP 管最上层为油脂，尽量吸除油脂，提高纯度，氯仿可重复1 次)。RT-PCR 法检测mRNA 表达量，PCR 反应条件:95 ℃10 min、95 ℃15 s、60 ℃1 min，40 个循环。引物由上海英骏公司合成，序列如下:GAPDH 上游:TCTTCCAGGAGCGAGATCCC，下游:TTCAGGTGAGCCCCAGCCTT;脂联素上游:CTGGCTCCAAGTGTATGGGG，下游:TTTGATTCTCGGG GCTACGG;IL-10 上游:AGAAGGACCAGCTGGACAACAT，下 游:CAAGTAACCCTTAAAGTCCTGCAGTA;TGF-β1 上游:AACTACTGCTTCAGCTCCAC，下游TGTGTCCAGGCTCCAAATGTA;TNF-α 上游:CCGATTTGCCACT TCATACCA，下游:TAGGGCAAGGGCTCTTGATG。

1.4 脂肪组织病理学检查 取脂肪组织4%多聚甲醛固定，冰冻切片并行HE 染色。

1.5 统计学分析 采用SPSS 19.0 统计软件进行分析，采用单因素方差分析，所有数据用s 表示，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脂肪组织肉眼改变 N 组:大鼠腹腔见极少量黄色腹水，附睾旁脂肪组织大致正常;SAP 组:腹腔可见少量血性腹水，附睾旁脂肪组织及周边脏器见大量皂化斑。

2.2 脂肪组织光镜下病理改变 N 组:脂肪组织大致正常;SAP 组:脂肪组织见周围毛细血管增生及单核巨噬细胞浸润增加。

图1 脂肪组织肉眼改变 A:N 组;B:SAP 组;图2 脂肪组织光镜下病理改变(HE 400 ×) A:N 组;B:SAP 组Fig 1 Adipose tissue changes by macroscopic observation A:N group;B:SAP group;Fig 2 Hispathological changes of adipose tissue (HE 400 ×) A:N group;B:SAP group

2.3 脂肪组织脂联素及炎症因子的表达

2.3.1 脂肪组织炎症因子的表达:与N 组相比，SAP 组促炎因子TNF-α 及IL-10 上升明显(P ＜0.05);抑炎因子TGF-β1 显著下降，差异有统计学意义(P ＜0.05)。

表1 两组脂肪组织炎症因子IL-10、TGF-β1、TNF-α 表达水平比较(ng/L，s)Tab 1 Comparison of expression levels of IL-10，TGF-β1，TNF-α between two groups (ng/L，s)

表1 两组脂肪组织炎症因子IL-10、TGF-β1、TNF-α 表达水平比较(ng/L，s)Tab 1 Comparison of expression levels of IL-10，TGF-β1，TNF-α between two groups (ng/L，s)

分组 IL-10 TGF-β1 TNF-α N 组 0.00097±0.00017 0.0595±0.0070 0.00153±0.0 0017 SAP 组 0.00272±0.00027 0.0182±0.0053 0.00317±0.00042 P 值0.002 0.012 0.004

2.3.2 脂肪组织脂联素的表达:与N 组相比，SAP 组脂联素下降明显，差异有统计学意义(P ＜0.01，见图3)。

图3 脂肪组织脂联素的表达 A:N 组;SAP 组Fig 3 The expression levels of adiponectin in the adipose tissues of normal and SAP group A:N group;B:SAP group

3 讨论

目前普遍认为SAP 发生、发展的机制是各种病因导致一系列细胞因子、免疫细胞及补体系统参与的炎症级联放大效应，这些细胞因子和炎症介质呈网络交叉反应，协同形成对组织器官的损伤。TNF-α 主要由活化的单核-巨噬细胞产生，是SAP 发病机制中的启动介质，它可刺激促炎因子的表达、趋化、细胞死亡及内皮细胞活化［3］。IL-10 是一种重要的炎症负反馈调节因子，它能够抑制单核-巨噬细胞、T 细胞的激活和效应功能，抑制TNF-α、IL-6 等促炎细胞因子的合成［4］。TGF-β1 是一种具有多重生物学活性的细胞因子，主要调节免疫、促进蛋白多糖、胶原蛋白等细胞外基质合成，抑制其降解，刺激结缔组织形成，它的表达对调控细胞增殖、分化、促进创伤修复及纤维化起重要作用。研究认为，由于全身炎症刺激及胰腺受损，静止的胰腺星形细胞(pancreatic stellate cells，PSC)被激活并转化为肌纤维母细胞，合成纤维连接蛋白、胶原等细胞外基质，促进创伤部位的纤维化［5］，而TGF-β 能使PSC 发生转化激活［6］。本实验中，TGF-β1 在SAP 脂肪组织中高表达，高度提示TGF-β1 可能与胰腺再生及修复密切相关。

脂肪组织不再被认为是单一的储脂器官，更重要的是内分泌及免疫功能，它同时也分泌TNF-α、TGFβ1、IL-1、IL-6 等细胞因子［7-8］。肥胖是SAP 及其并发症的危险因素［2］，其机制尚未完全清楚，研究脂肪组织具有迫在眉睫的意义，脂联素在SAP 脂肪组织中的表达国内外尚未有报道。脂联素由Scherer 等在1995年首次报道，是主要由脂肪细胞分泌、含量丰富的补体因子(C1q)，它参与糖脂代谢、抗炎、抗动脉粥样硬化、调节免疫、防止内皮细胞功能紊乱等许多重要的生理过程［9］。文献报道，SAP 血脂联素浓度与正常组相比，明显下降［10］;而上调脂联素受体能减轻SAP 的严重程度［11］。Araki 等［12］用基因敲除的方法证实缺乏脂联素基因的急性胰腺炎肥胖大鼠，其胰腺炎严重程度较正常胰腺炎组明显加重。本实验结果同样证实与正常对照组相比，SAP 组脂肪组织脂联素mRNA 低表达(P ＜0.0001)，提示脂肪组织脂联素与SAP 的发病可能具有一定的关联性，脂联素在SAP 中起保护性作用。

脂联素可能通过以下几种途径发挥在SAP 中的作用:(1)脂联素通过cAMP-PKA 途径抑制NF-κB 磷酸化，从而抑制TNF-α 介导的NF-κB 活化，进而抑制其诱生的血管黏附分子(VCAM)-1、细胞间黏附分子(ICAM)-1 的表达，且存在剂量依赖性［13］。体外实验给予外源性TNF-α，脂肪组织中脂联素mRNA 的表达量显著下调，脂联素受体1 表达明显上升［14］，进一步支持脂联素对TNF-α 的抑制作用。(2)抗炎因子IL-10 通过抑制NF-κB 通路的激活，在转录水平抑制炎性介质的产生［15］，而脂联素能诱导人类单核细胞合成IL-10 及可溶性IL-1 受体拮抗剂，体外实验中，Evans、Kumada 等［2，16］用人重组脂联素培养人类单核细胞源性巨噬细胞，均以剂量依赖性显著增加IL-10 mRNA及蛋白水平。(3)脂联素通过AMPK 信号传导途径促进内皮细胞eNOS 磷酸化，增强eNOS 在内皮细胞的表达和活性，内皮细胞NO 的生成有助于抑制血管炎症反应［17］。(4)SAP 患者肠黏膜屏障遭到破坏，肠黏膜的通透性增高，内毒素通过门静脉进入体循环，发生肠源性内毒素血症［18］，内毒素也可活化肥大细胞，脱颗粒释放组胺，进一步引起肠黏膜通透性增高，此种恶性循环是导致SAP 并发多器官衰竭的主要原因之一，而脂联素能够直接中和内毒素，并且降低脓毒败血症大鼠内毒素活性［19］。

脂肪组织作为内分泌及免疫组织，其所分泌的细胞因子对机体物质代谢、肥胖、SAP 及其并发症等有重要作用，脂肪细胞因子是衔接肥胖与SAP 之间重要的桥梁，深入认识脂联素在SAP 中的作用有可能为SAP的治疗开辟新的途径。

［1］ Zhu HH，Jiang LL. Serum inter-cellular adhesion molecule 1 is an early markerof diagnosis and prediction of severe acute pancreatitis［J］.World J Gastroenterol，2012，18(20):2554-2560.

［2］ Evans AC，Papachristou GI，Whitcomb DC. Obesity andthe risk of severe acute pancreatitis［J］. Minerva Gastroenterol Dietol，2010，56(2):169-179.

［3］ Malleo G，Mazzon E，Siriwardena AK，et al. Role of tumor necrosis factor-alpha in acute pancreatitis:from biological basis to clinical evidence［J］. Shock，2007，28(2):130-140.

［4］ Grutz G. New insights into the molecular mechanism ofinterleukin-10-mediated immunosuppression［J］. J Leukoc Biol，2005，77(1):3-15.

［5］ Masamune A，Shimosegawa T. Signal transduction in pancreatic stellate cells［J］. J Gastroenterol，2009，44(4):249-260.

［6］ Gao X，Cao Y，Yang W，et al. BMP2 inhibits TGF-β-induced pancreatic stellate cell activation and extracellular matrix formation ［J］.2013，304(9):G804-G813.

［7］ Simons PJ，van den Pangaart PS，van Roomen CP，et al. Cytokinemediated modulation of leptin and adiponectin secretionduring in vitro adipogenesis:evidence that tumor necrosisfactor-alpha-and interleukin-1beta-treated human preadipocytesare potent leptin producers［J］. Cytokine，2005，32(2):94-103.

［8］ Tilg H，Moschen AR. Adipocytokines:mediators linkingadipose tissueinflammation andimmunity［J］. Nat Rev Immunol，2006，6(10):772-783.

［9］ Antoniades C，Antonopoulos AS，Tousoulis D，et al. Adiponectin:from obesity to cardiovascular disease［J］. ObesRev，2009，10(3):269-279.

［10］ Zyromski NJ，Mathur A，Pitt HA，et al. A murine model of obesity implicates theadipokine milieu in the pathogenesis of severe acutepancreatitis［J］. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2008，295(3):G552-G558.

［11］ Al-Azzawi HH，Ziegler KM，Swartz-Basile DA，et al. Does adiponectin upregulation attenuate the severity of acute pancreatitis in obesity［J］. J Gastrointest Surg，2011，15(8):1394-1400.

［12］ Araki H，Nishihara T，Matsuda M，et al. Adiponectin plays a protective role in caerulein-inducedacute pancreatitis in mice fed a high-fat diet［J］. Gut，2008，57(10):1431-1440.

［13］ Ouchi N，Kihara S，Arita Y，et al. Adiponectin，anadipocyte-derived plasmaprotein，inhibits endothelial NF-kappaB signaling through a cAMPdependentpathway［J］. Circulation，2000，102(11):1296-1301.

［14］ Hector J，Schwarzloh B，Goehring J，et al. TNF-alpha alters visfatin and adiponectin levels in human fat［J］. Horm Metab Res，2007，39(4):250-255.

［15］ Dhingra S，Sharma AK，Arora RC，et al. IL-10 attenuates TNF-α induced NF-κB pathway activation and cardiomyocyte apoptosis［J］.Cardiovasc Res，2009，82(1):59-66.

［16］ Kumada M，Kihara S，Ouchi N，et al. Adiponectin specifically increasedtissue inhibitor of metalloproteinase-1 through interleukin-10 expression inhuman macrophages［J］. Circulation，2004，109(17):2046-2049.

［17］ Ouchi N，Kobayashi H，Kihara S，et al. Adiponectin stimulates angiogenesis by promoting cross-talk between AMP-activated protein kinase and Aktsignaling in endothelial cells［J］. J Biol Chem，2004，279(2):1304-1309.

［18］ Zhang J，Yuan C，Hua G，et al. Early gut barrier dysfunction in patients withsevere acute pancreatitis:attenuated by continuousblood purification treatment ［J］. Int J Artif Organs，2010，33(10):706-715.

［19］ Tsuchihashi H，Yamamoto H，Maeda K，et al. Circulating concentrationsof adiponectin，anendogenous lipopolysaccharide neutralizing protein，decrease in rats with polymicrobial sepsis ［J］. J Surg Res，2006，134(2):348-353.