乙型肝炎患者外周血CD4 + T 细胞Runx3 的表达及意义

张 毅，臧国庆，王洁玲，汤正好，江 红，奚 敏，余永胜

上海交通大学附属第六人民医院感染病科，上海200233

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一个严重的公共卫生问题。据统计，全球每年约有100万人死于HBV 感染所致的肝硬化、肝衰竭和原发性肝癌［1］。我国现有慢性HBV 感染患者约9 300 万人，其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者约2 000万人［2］。研究发现CHB 患者体内Th 细胞分化出现偏移，存在Th1、Th2 细胞及其分泌的细胞因子比例失衡［3］。Th1 型免疫应答低下使机体不能产生足量的细胞毒性T 淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)和Th1 型细胞因子以杀伤、破坏HBV 感染的靶细胞，HBV 复制不能得到抑制;而Th2 型细胞因子又可抑制Th1 细胞的免疫应答，使机体不能及时清除HBV，最终导致HBV 慢性持续感染［3］。Th1/Th2 失衡是CHB 发生、发展和不同转归的重要原因［4-6］。Runx3(runtrelated transcription factor 3)是一种肿瘤抑制基因，在机体正常生长、发育和肿瘤发生、发展过程中起着重要作用［7-8］。研究发现Runx3 是CD4+T 细胞分化过程中重要的转录因子，可以调节Th 细胞的分化，从而影响Th1/Th2 的平衡［9-11］。但目前尚无Runx3 与乙型肝炎的相关研究。本文旨在探讨乙型肝炎患者外周血CD4+T 细胞Runx3 的表达及意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2011 年6 月-2012 年12 月上海交通大学附属第六人民医院感染病科诊治的CHB患者37 例(CHB 组)，男23 例，女14 例，年龄21 ～58岁，平均年龄(38.1 ±16.5)岁，诊断符合2010 年《慢性乙型肝炎防治指南》［12］，其中轻度20 例、中度11例、重度6 例。急性乙型肝炎(acute hepatitis B，AHB)患者11 例(AHB 组)，男7 例，女4 例，年龄20 ～55岁，平均年龄(36.9 ±15.7)岁，诊断符合2000 年《病毒性肝炎防治方案》［13］。所有患者均排除其他肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、EB 病毒、巨细胞病毒等病原体感染，排除自身免疫性疾病、肿瘤等疾病。所有患者就诊前6 个月内均未使用过干扰素、核苷(酸)类似物等抗病毒药物和(或)胸腺肽等免疫调节药物。健康对照者19 名(健康对照组)，男12 名，女7 名，年龄23 ～56岁，平均年龄(37.8 ±14.6)岁，排除各系统疾病，6 个月内未使用过免疫调节药物。CHB 组、AHB 组、健康对照组之间性别、年龄相比，差异无统计学意义(P ＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂:RosetteSep 富集人CD4+T 细胞抗体(StemCell 公司)，人淋巴细胞分离液(StemCell 公司)，总RNA 提取试剂盒(Invitrogen 公司)，反转录试剂盒(Promega 公司)，荧光定量PCR 试剂盒(Takara 公司)。

1.2.2 外周血CD4+T 细胞分离:无菌条件下采集CHB 患者、AHB 患者和健康对照者肘静脉血各10 ml置于肝素抗凝管中;加入500 μl RosetteSep 富集人CD4+T 细胞抗体混合物，充分混匀，室温孵育20 min;用等体积含2% FBS 的PBS 稀释血液并缓慢混匀;将稀释血液按稀释血液:淋巴细胞分离液=2∶1 的比例在10 ml 淋巴细胞分离液的上面缓慢加入稀释的血液样品，室温1 200 r/min 离心20 min;收集位于淋巴细胞分离液与血浆界面之间的灰色细胞层;加入5 倍体积含2%的PBS 混匀，1 200 r/min 离心10 min，弃上清，再重复洗涤富集细胞1 次，分离得到CD4+T 细胞;流式细胞仪检测CD4+T 细胞纯度达90%以上，-80 ℃保存备用。

1.2.3 引物设计与合成:根据NCBI GenBank 公布的人Runx3 基因编码区序列，应用Primer Premier 5.0 软件设计引物，以GAPDH 基因为内参照。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下:Runx3 上游引物5＇-ACTGTGATGGCAGGCAATG-3＇;Runx3 下 游 引 物5＇-GTGATGGTCAGGGTGAAACTC-3＇;GAPDH 上游引物5＇-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3＇;GAPDH 下游引物5＇-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3＇。

1.2. 4 总RNA 提取与反转录合成cDNA:按照Invitrogen 公司的总RNA 提取试剂盒说明书进行操作提取总RNA;按照Promega 公司的反转录试剂盒说明书进行操作反转录合成cDNA，反应条件(20 μl 反应体系):42 ℃孵育60 min，70 ℃灭活10 min。 -80 ℃保存备用。

1.2.5 实时定量PCR 检测Runx3 mRNA 表达水平:在ABI 7500 PCR 仪上进行实时定量PCR 检测，按照Takara 公司的荧光定量PCR 试剂盒说明书进行操作，每份cDNA 做3 个重复管。PCR 反应体系:SYBR Premix Ex Taq 12.5 μl，上下游引物各0.5 μl，cDNA 模板1. 0 μl，ddH2O 10. 5 μl。PCR 反应条件:预变性95 ℃5 min，变性95 ℃15 s，退火60 ℃1 min，共40个循环。PCR 循环结束后对扩增曲线进行分析，3 个重复管取平均Ct 值计算，并对所扩增的PCR 产物熔解曲线进行分析。应用2-△△Ct法计算Runx3 mRNA的相对表达水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0 统计软件进行分析，计量资料用±s 表示，组间比较采用LSD-t 检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组外周血CD4+T 细胞Runx3 mRNA 表达水平 CHB 组Runx3 mRNA 的表达水平明显低于AHB组和健康对照组(P ＜0.01)，AHB 组Runx3 mRNA 的表达水平明显高于健康对照组(P ＜0.05，见表1)。

表1 各组外周血CD4 +T 细胞Runx3 mRNA 表达水平(±s)Tab 1 Runx3 mRNA expression in peripheral CD4 +T cells of each group (±s)

表1 各组外周血CD4 +T 细胞Runx3 mRNA 表达水平(±s)Tab 1 Runx3 mRNA expression in peripheral CD4 +T cells of each group (±s)

注:与健康对照组比较，▲P ＜0.01，●P ＜0.05;与AHB 组比较，* P ＜0.01。

组别 例数Runx3 mRNA CHB 组 37 0.48 ±0.09▲＊AHB 组 11 0.87 ±0.12 ●健康对照组19 0.79 ±0.17

2.2 CHB 患者轻、中、重度组外周血CD4+T 细胞Runx3 mRNA 表达水平 CHB 重度组Runx3 mRNA的表达水平明显高于CHB 轻度组(P ＜0.05);CHB 轻度组与CHB 中度组、CHB 中度组与CHB 重度组Runx3 mRNA 的表达水平相比，差异无统计学意义(P ＞0.05，见表2)。

表2 CHB 患者外周血Runx3 mRNA 表达水平(±s)Tab 2 Runx3 mRNA expression in CHB patients (±s)

表2 CHB 患者外周血Runx3 mRNA 表达水平(±s)Tab 2 Runx3 mRNA expression in CHB patients (±s)

注:与轻度组比较，* P ＜0.05。

组别 例数Runx3 mRNA轻度组20 0.39 ±0.18中度组 11 0.55 ±0.23重度组 6 0.65 ±0.27*

3 讨论

乙型肝炎自然感染率高，80% ～90% 的儿童和5% ～10%的成年人感染HBV 后会转变为慢性HBV携带者，成为慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌发病的高危人群［14-15］。CHB 发病机制非常复杂，目前尚未完全阐明。

在HBV 特异性抗原的刺激下，初始CD4+T 细胞在不同细胞因子的作用下分化为Th1、Th2 等细胞亚群。Th1、Th2 细胞的分化状态及其相互之间的平衡在机体抗HBV 的免疫应答中起着重要作用［4-6］。Kasahara 等［16］研究发现Th1 细胞依靠其分泌的多种细胞因子发挥直接抗HBV 或间接免疫调节作用，同时其分泌的细胞因子是机体产生HBV 特异性CTL 的必要条件。Penna 等［17］研究发现Th1 型细胞因子可造成肝细胞的损伤，但其在AHB 的恢复过程中发挥了重要作用。Maruyama 等［18］研究发现Th2 细胞及其细胞因子与HBV 持续感染有关。当Th1 细胞亚群占优势时，将促进细胞免疫反应，增强CD8+T 细胞的活性，从而清除肝细胞内的病毒，但同时增加了肝脏的炎症反应而加重肝细胞的损伤;当Th2 细胞亚群占优势时，将促进体液免疫反应，并抑制细胞免疫反应，CTL 活性减弱，肝细胞损伤减轻［19］。

Runx3 基因于1994 年由Levanon 等［7，20］研究发现，曾先后被命名为AML2、PEBP2αC 和CBFA3。人Runx3 基因位于染色体1p36.1，基因全长约67 kb，含有2 个启动子、6 个外显子和1 290 bp 的开放阅读框［20-21］。Runx3 是调节Th 细胞分化重要的转录因子，其可以通过增强T-bet(T-box expressed in T cells)或减弱GATA3(GATA binding protein 3)的转录活性，促使CD4+T 细胞向Th1 细胞分化［9-11］。Djuretic 等［10］研究发现Runx3 在Th1 细胞中以T-bet 依赖的方式被诱导，Th1 细胞中IFN-γ 的大量产生和IL4 基因的沉默需要T-bet 和Runx3 的共同作用;在Runx3 缺失的Th2细胞中，T-bet 不能抑制IL4，但T-bet 和Runx3 共同作用却能显著抑制IL4。Kohu 等［11］研究发现Runx3 在Th2 细胞中也能被诱导，它可以与GATA3 相互作用并削弱GATA3 的转录活性，Runx3 过表达能促使Th 细胞向Th1 细胞分化，并下调Th2 细胞的免疫应答。

本研究显示，CHB 组Runx3 mRNA 的表达水平明显低于AHB 组和健康对照组，而AHB 组Runx3 mRNA 的表达水平明显高于健康对照组。CHB 患者Runx3 低水平表达不能有效促进Th1 细胞免疫应答，无法清除体内病毒，从而使机体处于HBV 持续感染状态。Brooks 等［22］研 究 发 现CHB 患 者 体 内 存 在Th1/Th2失衡，Th1 细胞反应不足，Th1 型免疫应答低下而Th2 型免疫应答亢进，Th1 细胞减少是乙型肝炎保护性抗体不能产生的重要原因。Maini 等［23］研究发现急性自限性HBV 感染主要是细胞免疫反应的结果，细胞因子多为Th1 型，而慢性HBV 感染细胞免疫反应很弱或测不出，体液免疫却相对较强，细胞因子多为Th2 型。

本研究还显示，CHB 重度组Runx3 mRNA 的表达水平明显高于CHB 轻度组。Jiang 等［24］研究发现慢性HBV 感染者Th1 细胞随肝脏炎症活动的加剧而明显增多，而Th2 细胞比例在慢性HBV 感染的不同阶段则较为恒定，但均明显高于健康对照组。Löhr 等［25］研究发现急性重症乙型肝炎患者Th1 细胞的增殖反应比急性非重症乙型肝炎患者强，类似结果在慢性重症乙型肝炎患者中也得到证实。

综上所述，Runx3 在CHB 的发病过程中可能发挥了重要作用，CHB 患者Runx3 表达水平降低可能与Th1/Th2 失衡有关，但能否通过上调Runx3 的表达水平促使CHB 患者外周血Th 细胞向Th1 细胞分化和Th1 型细胞因子的分泌从而促进HBV 的清除还有待进一步研究。

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