扎里奴思方对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠p-糖蛋白的影响

扎里奴思方对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠P-糖蛋白的影响

李娟吴鹏1刘敬霞刘洋

(宁夏医科大学附属国医中医医院，宁夏银川750004)

摘要〔〕目的比较缺血损伤不同时段大鼠血脑屏障P-糖蛋白(P-gp) 时征表达及回药扎里奴思方对其表达的影响。方法SD大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组、扎里奴思方组，线栓法制备脑缺血再灌注模型，分别灌胃给药，于缺血再灌注后1、3、7、14 d取脑，检测大鼠脑皮质及海马区P-gp的表达。结果免疫组织化学染色结果显示，假手术组与模型组大鼠脑皮质及海马缺血区均可见P-gp阳性染色。与假手术组比较，不同再灌注时间模型组P-gp表达量均有显著性差异( P<0.01) ，皮质及海马缺血区P-gp 表达量均升高;与模型组比较，扎里奴思方组及尼莫地平组大鼠脑皮质及海马区P-gp表达量明显降低，尤以扎里奴思方3、14 d组为明显(P<0.01) 。结论扎里奴思方发挥抗脑缺血损伤、神经元保护作用机制可能是通过调节血脑屏障上P-gp的双向表达而实现的。

关键词〔〕扎里奴思方；脑缺血再灌注损伤；血脑屏障；P-糖蛋白

中图分类号〔〕R743〔文献标识码〕〔

基金项目：国家自然科学基金(No.81260569)；宁夏科技支撑计划(No.2012ZYH230)

通讯作者：刘敬霞(1970-)，女，博士，副教授，硕士生导师，主要从事中医、回医药防治老年病研究。

1固原市人民医院

第一作者：李娟(1987-)，女，硕士，主要从事中医、回医药防治脑缺血性疾病的研究。

Effects of Zhalinusi Fang on the P-glycoprotein changes after focal cerebral ischemia-reperfusion in rats

LI Juan, WU Peng,LIU Jing-Xia,etal.

Chinese Medicine Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，Ningxia, China

Abstract【】ObjectiveTo research the P-glycoprotein(P-gp) expression on the blood-brain barrier at different times and the effect of Zhalinusi Fang after focal cerebral ischemia-reperfusion(I/R) in rats.MethodsSD rats were divided randomly into sham-operated，model，nimodipine and Zhalinusi Fang groups. Rat focal cerebral I/R model was established by middle cerebral artery occlusion with nylon thread.After rats were administered orally with corresponding drugs 1,3,7,14 d,the brain was taken out.Immunohistochemical method was used to detect P-gp expression in cerebral cortex and hippocampus.ResultsImmunohistochemical staining showed that in sham-operated and model groups, P-gp positive staining was visible at ischemic cerebral cortex and hippocampus region . Compared with that of sham-operated group, P-gp expressions of different reperfusion time model groups were significant different(P<0.01),P-gp expression at ischemic cortex and hippocampus were increased. Compared with those of model group, of P-gp expression at cerebral cortex and hippocampus of ZLNSF and nimodipine groups were significantly decreased (P<0.01).ConclusionsZhalinusi Fang could promote the cerebral protection,its mechanism may be related to bidirectional regulation the expression of P-gp at blood-brain barrier.

【Key words】Zhalinusi Fang(ZLNSF);Cerebral ischemia-reperfusion injury;Blood-brain barrier; P-glycoprotein

缺血性脑血管病是临床多发病,可导致患者肢体功能缺损、生活质量下降等严重后遗症，危害着人类的健康。现治疗多从调控血脑屏障通透性方面进行研究〔1〕。P-糖蛋白(P-gp)在脑毛细血管内皮细胞上有着高度的表达，是阻碍药物传递入脑的主要物质〔2〕。扎里奴思方是出自《回回药方》治疗脑病的常用方剂，本研究拟采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型进一步、探讨其发挥抗脑缺血损伤、神经元保护作用是否通过调控血脑屏障上P-gp的表达变化实现的，为深入研究回族医药其脑保护作用的实验依据。

1材料与方法

1.1动物雄性SD大鼠，清洁级，3～4月龄，体重(300±50)g，由宁夏医科大学实验动物中心提供，合格证号：NXXY(宁)2001-0001。

1.2药物扎里奴思方(出自《回回药方》，方药组成：安息香3 g、干祖伐(即怀牛膝)24 g、法里公(即茴香)、兀沙吉(即乳香)、法忒刺撒里荣(即当归)、木里叶(即没药)、撒法郎(即红花)、芦荟、伯思八牙(即水龙骨)、腽肭脐(即海狗肾)、阿夫忒蒙(即菟丝子)、石菖蒲各12 g、肉桂6 g、丹皮9 g)制剂由吴忠市回医中医院制剂室提供,方中所用生药材去除杂质，按组方剂量配比，煎煮滤取煎液后浓缩至药液含生药3.0 g/ml，4℃保存备用；用前稀释至生药材含量为1.5 g/ml。尼莫地平片(拜耳医药保健有限公司提供，30 mg/片，批号：H20003010)，用蒸馏水配成混悬液(1.08 mg/ml)。

1.3主要试剂和仪器蒸馏水(宁夏医科大学实验动物中心提供);水合氯醛(上海五联化工厂,分析纯,蒸馏水配成10%溶液W/V);尼龙线(直径0.26 mm，长5 cm，用细砂纸打磨使头端光滑、钝圆、再用肝素溶液浸泡5 min,晾干,紫外线消毒备用)；电热恒温干燥箱(FX4-2，Shellab公司);电子天平(BT224S，Sartorius公司)；病理图像分析软件(技易科技)，P-gp(SC-673，稀释至1∶64，试剂购自Santa cruz Biotechnology)。

1.4分组与给药随机抽取10只作为假手术组，余成模后随机分至模型、尼莫地平、扎里奴思方1、3、7、14 d组内。所有动物于成模清醒后2 h按相应分组灌胃给药,给药剂量按动物与人体表面积折算：扎里奴思方1.5 g/ml；尼莫地平1.08 mg/ml，模型组和假手术组以生理盐水代替，1次/d。

1.5动物模型的制备参照线栓法制备局灶性脑缺血动物模型。10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后固定，颈正中切口，钝性分离颈内外动脉，穿线备用；于颈外动脉近动脉分叉处剪口，穿入栓线，进线长度(19±2)mm，穿线成功后记录时间，缝合皮肤，在2 h后进行缺血再灌注，拔出栓线后缝合皮肤。假手术组只分离颈总、颈内外动脉，不穿入栓线。手术过程中保持大鼠肛温(37.0±0.5)℃,保持室温(26±1)℃。

1.6脑组织P-gp水平测定通过P-gp含量来评价血脑屏障通透性的变化。用Image Pro Plus 6.0图像全自动分析系统分析P-gp表达。测出iod sum和area sum值，取其平均值，平均光密度值=iod sum/area sum，反映P-gp含量的表达。

2结果

假手术组与模型组大鼠脑皮质及海马缺血区均可见P-gp阳性染色。与假手术组比较，不同再灌注时间模型组P-gp 表达量均有显著升高(P<0.01)，皮质及海马缺血区P-gp表达量显著升高与模型组比较，扎里奴思方组及尼莫地平组大鼠脑皮质及海马区P-gp 表达量明显降低，尤以扎里奴思方3、14 d组、尼莫地平7 d组最明显(P<0.01) 。组内比较：与模型1 d组相比，3 d组P-gp表达明显增加达高峰，7～14 d其含量逐渐回落；扎里奴思方与尼莫地平组3 d达高峰至7、14 d P-gp表达呈逐渐降低趋势(P<0.05，P<0.01)。见表1。

组别1d3d7d14d假手术组83.43±13.8483.43±13.8483.43±13.8483.43±13.84模型组138.075±9.881)153.853±3.181)5)146.41±17.131)5)6)145.59±8.461)5)6)尼莫地平组137.83±4.051)146.78±18.701)2)5)129.39±11.911)2)5)6)119.22±8.251)2)5)6)扎里奴思方组127.89±17.231)142.69±9.121)2)3)5)140.34±15.841)2)4)5)117.13±9.101)2)5)6)

与假手术组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05；与尼莫地平组比较：3)P<0.05，4)P<0.01；与1 d组比较：5)P<0.01；与3 d组比较：6)P<0.01

3讨论

血脑屏障(BBB)是脑与血液及脑脊液之间的一种屏障,与中枢神经系统的变性、损伤密切相关。其阻碍机制通常分为两部分〔3，4〕：①结构导致的，对于大分子物质的物理屏障；②由其上面的多种信号物质导致的，对小分子物质起作用的化学电荷屏障。P-gp在维持BBB屏障功能、保持脑内环境的稳定、限制外源性毒物或药物进入方面有重要作用,但同时也限制了治疗性药物在脑内的浓度,从而使治疗效果减弱〔5～9〕。在缺血中风性疾病中，深入研究P-gp功能及作用机制有助于选择性调控BBB功能,对提高脑内药物的浓度和中枢神经系统药物的生物利用度具有重要意义。本实验结果显示,脑缺血后模型组呈现了针对脑损伤的P-gp反应性表达增加又逐渐下降趋势，药物组的表达趋势相同；但是，脑缺血治疗引起的P-gp表达量改变及持续时间均显示治疗后P-gp的表达对缺血损伤的神经元起到了全面而持久的保护作用〔10，11〕。因此，采用可调控P-gp双向表达的治疗措施，对缺血后神经元损伤的保护具有重要意义。前期研究〔12～14〕发现，扎里奴思方具有抗脑缺血损伤、神经元保护作用。本研究进一步显示：扎里奴思方在一定时限可以促进大鼠脑缺血再灌注损伤后P-gp的表达，加强有害物质的外排；然而在缺血再灌注损伤3 d后，其表达又趋于抑制，P-gp的表达量急速回落，且随着时间的延长其抑制作用逐步增强，而这种变化趋势与脑缺血后BBB通透性的变化几乎一致〔15〕。

扎里奴思方具有芳香开窍、益髓补肾、活血祛瘀等作用，切中脑中风后痰蒙神窍、气虚血瘀等诸病机，有很好的抗缺血损伤、神经元保护作用，后期可以减轻缺血脑组织中P-gp的渗出，减少治疗性的药物外排，增加药物在脑内浓度，从而起到BBB保护性治疗作用，还可以减少有害物质的进入和脑实质水肿的发生，改善受损神经功能恢复。本文结果也显示扎里奴思方可有效改善术后大鼠脑组织病理损伤和促进大鼠神经功能恢复，且其作用随着用药时间延长而逐步增强，其变化趋势与P-gp变化趋势一致，本文可认为扎里奴思方对脑缺血再灌注后脑组织的保护作用可能是通过调节BBB中P-gp的表达实现的。

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〔2013-11-15修回〕

(编辑曲莉)