莪术多糖对Lewis肺癌小鼠的抑制作用及机制

莪术多糖对Lewis肺癌小鼠的抑制作用及机制

陈志强张英志

(桐乡市第一人民医院呼吸科,浙江桐乡314500)

摘要〔〕目的探讨莪术多糖(CZP)对小鼠Lewis肺癌的抑制作用及可能机制。方法5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测CZP对Lewis肺癌细胞体外生长的抑制作用及对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响，中性红比色法检测CZP对小鼠脾巨噬细胞吞噬活性的影响；建立Lewis肺癌荷瘤小鼠模型，检测CZP对Lewis 肺癌荷瘤小鼠肿瘤生长、脏器指数及细胞免疫因子的影响。结果体外实验表明，CZP对Lewis肺癌细胞生长具有显著抑制作用，能显著增强淋巴细胞增殖能力和巨噬细胞吞噬活性(P<0.05或P<0.01)；体内实验表明，CZP对Lewis肺癌荷瘤小鼠的抑瘤率分别为26.9%、31.9%和39.7%，荷瘤小鼠脾脏指数、白细胞介素(IL)-2、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ水平均显著提高(P<0.05或P<0.01)。结论CZP对小鼠Lewis肺癌具有抑制作用，可改善Lewis肺癌荷瘤小鼠的免疫功能，通过激活机体免疫系统实现有效的抗肿瘤作用和免疫调节功能。

关键词〔〕莪术多糖；Lewis肺癌；免疫功能

中图分类号〔〕R734〔文献标识码〕A〔

基金项目：嘉兴市科技局项目(2012AY1070-1)

通讯作者：张英志(1984-)，男，主治医师，主要从事肺癌放化疗研究。

第一作者：陈志强(1975-)，男，主治医师，主要从事肺癌的分子细胞学机制研究。

莪术为姜科姜黄属多年生草本植物，为传统中药材之一，应用历史悠久，具有抗肿瘤、抗菌、保肝、升高白细胞等作用〔1〕。莪术中的主要活性成分包括莪术油、莪术醇等〔2，3〕，而关于莪术多糖(CZP)的研究报道较少。鉴于已有大量关于植物多糖具有抗肿瘤活性的报道〔4〕，本文以莪术的水溶性成分CZP为研究对象，开展对小鼠Lewis肺癌的抑制作用及机制的相关研究，为后续的药物研发奠定相关基础。

1材料与方法

1.1试药CZP为本实验室自制；环磷酰胺、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)和胎牛血清购制美国Sigma公司；白细胞介素(IL)-2、肿瘤坏死因子(TNF)-α和干扰素(IFN)-γ测定试剂盒购自美国R&D公司；其它试剂为国产分析纯。

1.2瘤株与实验动物Lewis肺癌细胞购于北京协和医科大学细胞库；6~8周龄C57BL/6J小鼠，体重(20.0±2.0)g，由浙江大学实验中心提供。

1.3方法

1.3.1MTT法检测细胞增殖用DMEM/F12培养液(10%小牛血清)培养Lewis肺癌细胞至对数生长期，用胰蛋白酶(0.25%)消化，调整细胞密度至1×105/ml，接种于96孔板中，每孔体积为100 μl，设对照组，环磷酰胺(CTX，25 μg/ml)组，50、100、200 μg/ml CZP给药组，每组设3个复孔，分别培养24、48和72 h。在培养结束前4 h，于每孔内加5 mg/ml的MTT溶液15 μl，混匀后继续孵育4 h，弃上清，加DMSO 150 μl，混匀后用酶标仪测492 nm处吸光度(A)值，计算抑制率。

1.3.2MTT法检测CZP对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响采用常规方法制备C57BL/6J小鼠脾淋巴细胞，设对照组、50、100、200 μg/ml CZP给药组，每组设3个复孔，5 μg/ml Con A和10 μg/ml LPS组，其他步骤同上，培养48 h，MTT法测492 nm处A值，计算相对增殖率。

1.3.3吞噬中性红法测定小鼠脾巨噬细胞活性常规方法制备正常C57BL/6J小鼠脾巨噬细胞，RPMI 1640培养液调整细胞密度为1×106/孔，加入96孔板中，每孔100 μl。设对照组、50、100、200 μg/ml CZP给药组，每组设3个复孔，终体积为每孔200 μl。细胞培养48 h后，每孔吸弃100 μl上清，然后加入中性红溶液100 μl，培养30 min，离心，弃上清，用PBS洗3次，加200 μl裂解液室温过夜，测589 nm处A值，计算吞噬率。

1.3.4体内抗肿瘤实验取接种14 d、生长良好的Lewis肺癌细胞，在冰浴条件下以生理盐水稀释成1×107/ml的细胞悬液，以每只0.2 ml细胞悬液接种于小鼠右腋皮下。随机分为对照组，CTX 25 mg/kg组，CZP低、中、高剂量(50、100、200 mg/kg)组，每组8只，雌雄各半。CZP以生理盐水作为溶剂，每天腹腔注射1次，注射剂量均为0.2 ml，连续给药21 d。末次给药24 h后，称小鼠体质量，眼球取血，制备血清，-20℃储存备用。颈椎脱臼处死小鼠，取脾脏、肺脏、肾脏及瘤块，计算脾脏指数、肾脏指数、肺脏指数及抑瘤率。

1.3.5酶联免疫吸附(ELISA)法检测小鼠血清中免疫分子水平按照商品化的试剂盒说明书中的操作步骤，采用间接ELISA法检测小鼠血清中IL-2、TNF-α和IFN-γ含量。

2结果

2.1CZP对Lewis肺癌细胞增殖的影响各剂量组对Lewis肺癌细胞的增殖均有明显的抑制作用(P0.01)，且具有剂量依赖效应；同时，随着作用时间的延长，抑制作用明显增强，具有时间依赖效应。见图1。

2.2CZP对小鼠脾淋巴细胞增殖和巨噬细胞吞噬活性的影响与对照组相比，CZP各剂量组小鼠脾淋巴细胞增殖活性均显著增高(P<0.05或P<0.01)，而与Con A组和LPS组无显著差异(P>0.05)；CZP对小鼠巨噬细胞吞噬活性有促进作用，与对照组相比差异显著(P<0.05或P<0.01)，见表1。

2.3CZP对荷瘤小鼠脾脏、肾脏、肺脏指数的影响CTX可以显著降低荷瘤小鼠脾脏指数(P<0.05)，而低、中、高剂量的CZP均可以显著提升荷瘤小鼠脾脏指数(P<0.05 或P<0.01)；而无论是CTX还是CZP给药组，对荷瘤小鼠肾脏及肺脏指数均无显著性影响(P>0.05)。见图2。

与对照组比较：1)P<0.01，表2同 图1　CZP对Lewis肺癌细胞增殖的影响(x-±s，n=3)

组别剂量(μg/ml) 脾淋巴细胞 巨噬细胞 吸光度(A)淋巴细胞增殖率(%)吸光度(A)巨噬细胞吞噬率(%)对照组-1.01±0.11100.00.53±0.04100.0CZP组501.13±0.09118.81)0.66±0.05124.51)1001.37±0.08135.62)0.82±0.09154.72)2001.55±0.17152.52)0.95±0.13179.22)ConA组51.76±0.13174.22)--LPS组101.59±0.12157.42)--

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；图2同

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01 图2　CZP对Lewis肺癌荷瘤小鼠脾脏指数、肾脏指数和 肺脏指数的影响(x-±s，n=8)

2.4CZP对小鼠Lewis肺癌生长的影响CTX对小鼠Lewis肺癌生长的抑制作用最为明显，抑制率高达61.4%；各剂量组的CZP对Lewis肺癌的生长也具有明显的抑制，抑制率分别为26.9%、31.9%和39.7%，与对照组比较差异显著(P<0.05)。

2.5CZP对荷瘤小鼠血清免疫因子的影响与对照组相比，CTX组小鼠血清中IL-2、TNF-α及IFN-γ的水平与对照组比较显著降低(P<0.05 或P<0.01)。而低、中、高剂量的CZP均可显提升IL-2、TNF-α及IFN-γ的水平(P<0.01)，见表2。

表2CZP对Lewis荷瘤小鼠血清免疫因子的影响

组别剂量(mg/kg)IL-2TNF-αIFN-γ对照组-94.53±9.7359.83±8.0211.44±1.68CTX2541.29±7.051)41.27±6.841)5.32±0.911)CZP5098.75±13.191)73.14±9.951)16.46±2.281)100129.64±13.721)92.37±10.261)19.72±2.121)200145.93±15.371)129.72±11.891)21.29±1.351)

3讨论

恶性肿瘤严重威胁人类健康和生命，其发病率和死亡率在许多国家和地区均高居首位。近年来，随着抗肿瘤新药的不断涌现，使肿瘤化疗同放疗和手术治疗一样，成为治疗肿瘤的重要手段之一〔5〕。但现有的化疗药物对大多数实体瘤的疗效不甚理想，加之在应用过程中伴随着耐药性和较严重的副作用，使得研究人员迫切希望找到低毒、高效的抗肿瘤药物。鉴于中医药在治疗癌症方面有其独到之处，从传统中药材中筛选抗肿瘤活性成分以及抗肿瘤先导化合物已成为该领域的研究焦点〔6〕。目前，来源于植物药的抗癌制剂已占总抗癌药物的30%以上，其中紫杉醇、长春新碱、喜树碱等已成为许多肿瘤化疗的首选药〔7〕。我国药用植物资源极为丰富，从传统中药中筛选抗肿瘤有效成分，并明确其抗肿瘤作用及机制，对于抗肿瘤药物的开发具有非常重要的意义。

植物多糖的抗肿瘤作用与免疫功能的改善密切相关〔8〕。采用MTT及吞噬中性红法分别检测CZP对淋巴细胞增殖能力和巨噬细胞吞噬活性的影响，发现CZP具有增强淋巴细胞增殖能力和巨噬细胞吞噬活性的作用；同时，通过体内实验也证实，CZP具有增加荷瘤小鼠脾脏指数的作用。肿瘤发生时，在分子水平上机体内IL-2、TNF-α及IFN-γ等免疫因子表达增多，从而提高免疫功能而发挥抗肿瘤作用。IL-2是细胞因子网络的重要成员，具有促进淋巴细胞分裂、增强对杀伤细胞的杀伤作用和辅助抗体生成等生物学功能〔9〕。TNF-α是来源于活化的单核细胞，具有凋亡、坏死、激活淋巴细胞因子等各种抗肿瘤活性；同时，TNF-α可以与IL-2等相互作用从而发挥一系列的免疫作用〔10〕。IFN-γ是调节免疫系统的主要细胞因子，作用于免疫系统的多个环节，其作用主要为激活巨噬细胞和上调主要组织相容性复合体(MHC)分子的表达〔11〕。本研究结果表明CZP可以通过提高免疫因子水平从而起到抑制Lewis肺癌的作用。

综上所述，CZP对小鼠Lewis肺癌具有抑制作用，可改善Lewis肺癌荷瘤小鼠的免疫功能，通过激活机体免疫系统实现有效的抗肿瘤作用和免疫调节功能。因此，CZP在未来有望作为一种低毒、高效的抗肿瘤成分，与一些化疗药物合用以提高患者的生活质量，具有良好的应用前景。

参考文献4

1曾建红，黄庆龙，陈旭，等.莪术抗癌活性成分的研究进展〔J〕.中华中医药杂志，2008；23(5)：426-8.

2梁莉萍，贾存东.莪术油对乳腺癌癌前病变大鼠的治疗效果及作用机制〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(12)：2821-3.

3王耀霞，徐立春.莪术醇抗肿瘤研究进展〔J〕.医学综述，2009；15(22)：3483-6.

4林俊，李萍，陈靠山.近5年多糖抗肿瘤活性研究进展〔J〕.中国中药杂志，2013；38(8)：1116-25.

5Zeremski V，Savic A.Post-remission therapy of adult acute myeloid leukemia：high dose cytosine-arabinoside versus other consolidation regimens〔J〕.Med Pregl，2014；67(3-4)：83-90.

6徐珊，徐昌芬.肿瘤多药耐药性发生机制及中药逆转作用的研究进展〔J〕.中国肿瘤生物治疗杂志，2006；13(6)：400-11.

7Ando M，Yonemori K，Katsumata N，etal.Phase I and pharmacokinetic study of nab-paclitaxel，nanoparticle albumin-bound paclitaxel，administered weekly to Japanese patients with solid tumors and metastatic breast cancer〔J〕.Cancer Chemother Pharmacol，2012；69(2)：457-65.

8Cai ZB，Li W，Wang HT，etal.Antitumor effects of a purified polysaccharide from Rhodiola rosea and its action mechanism〔J〕.Carbohyd Polym，2012；90(1)：296-300.

9Rosenberg SA.IL-2：The first effective immunotherapy for human cancer〔J〕.J Immunol，2014；192(12)：5451-8.

10Alokail MS，Al-Daghri NM，Mohammed AK，etal.Increased TNF α，IL-6 and ErbB2 mRNA expression in peripheral blood leukocytes from breast cancer patients〔J〕.Med Oncol，2014；31(8)：38.

11Gerber SA，Sedlacek AL，Cron KR，etal.IFN-γ mediates the antitumor effects of radiation therapy in a murine colon tumor〔J〕.Am J Pathol，2013；182(6)：2345-54.

〔2013-10-10修回〕

(编辑李相军/滕欣航)