左乙拉西坦对癫痫大鼠海马组织中5-HT2A受体表达及其认知功能的影响

左乙拉西坦对癫痫大鼠海马组织中5-HT2A受体表达及其认知功能的影响

聂磊张涛1王海燕邹艳红王影李春玉王禹迟瑛娇赵塔娜赵冬梅

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154002)

摘要〔〕目的探讨左乙拉西坦(LEV)对癫痫大鼠海马组织中5-羟色胺2A(5-HT2A)受体动态表达及对认知功能的影响。方法108只Wistar大鼠随机分为对照组(NS)24只、正常给药组(LEV)24只、癫痫模型组(Li-PILO)30只、癫痫给药组(Li-PILO+LEV)30只，分别给予LEV组和Li-PILD+LEV组大鼠LEV 200 mg/kg 1次/d灌胃，连续28 d。采用RT-PCR方法分别在第7、14、28天动态检测大鼠海马组织中5-HT2A受体的表达，Morris水迷宫实验测试大鼠的空间学习记忆。结果LEV与NS组5-HT2A受体表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；与NS组比较，Li-PILO组在第7天时表达水平降低，且随时间延长降低水平越明显，即在第14、28天5-HT2A受体表达水平明显降低(P<0.05)；与Li-PILO型组比较，Li-PILO+LEV组5-HT2A受体在第7、14、28天表达水平明显升高(P<0.05)。与Li-PILO组比较，Li-PILO+LEV组的逃避潜伏期明显缩短、穿越平台次数显著增加(均P<0.05)。结论LEV的抗癫痫作用可能与通过上调5HT-2A受体的表达有关，其在抗癫痫的同时还可以改善大鼠的空间学习记忆。

关键词〔〕左乙拉西坦；癫痫；5-羟色胺2A受体；氯化锂-匹罗卡品

中图分类号〔〕R742.1〔文献标识码〕A〔

基金项目：黑龙江省卫生厅科研课题(No.2013-230)

通讯作者：张涛(1964-)，女，教授，博士，硕士生导师，主要从事抗肿瘤与抗衰老的研究。

1佳木斯大学基础医学院

第一作者：聂磊(1977-)，男，主治医师，硕士，主要从事小儿神经系统疾病的研究。

癫痫是儿科常见的神经系统疾病之一〔1，2〕。许多抗癫痫药物会使患儿的认知功能受到不同程度的损害，因此需要寻求一种既有抗癫痫作用又有脑保护作用的抗癫痫药物。左乙拉西坦(LEV)抗癫痫机制独特，通过与中枢神经元突触囊泡蛋白结合而达到抗癫痫作用。LEV与突触囊泡蛋白有很高的结合能力，结合后可以与抑制神经元异常放电，从而发挥抗癫痫的作用〔3〕。研究发现，LEV对于治疗多种癫痫发作类型有显著效果并有改善认知功能的作用〔4，5〕。本课题通过建立氯化锂-匹罗卡品(Li-PILO)癫痫大鼠模型，初步探讨LEV对癫痫大鼠海马组织中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和5-羟色胺2A(5-HT2A)受体表达及学习记忆功能的影响。

1材料与方法

1.1实验动物及分组108只清洁级的Wistar大鼠(由大连医科大学动物实验中心提供)，体重(90±10)g，随机分为对照组(NS)24只、正常给药(LEV)24只、癫痫模型组(Li-PILO)30只、癫痫给药组(Li-PILO+LEV)30只。

1.2实验试剂和癫痫模型建立Li-PILO(Sigma公司)，LEV(UCB S.A.Belgim公司)，RT-PCR试剂盒和引物合成(北京华迈科生物技术有限公司)。动物模型的建立过程参照相关文献〔6〕并稍有改进，将Li-PILO组及Li-PILO+LEV组大鼠先腹腔注射氯化锂120 mg/kg，20 h后，再腹腔注射东莨菪碱1 mg/kg拮抗外周胆碱能反应，30 min后再次腹腔注射皮罗卡品80 mg/kg，并观察大鼠的行为。大鼠的癫痫发作分级参照RACINE分级，0级：无反应或抽搐停止；Ⅰ级：面部抽动、咀嚼；Ⅱ级：面部抽动、咀嚼、点头；Ⅲ级：面部抽动、咀嚼、点头、前肢或后肢抽动；Ⅳ级：面部抽动、咀嚼、点头、前肢或后肢抽动、多肢抽动或强直；Ⅴ级：全面性强直阵挛发作。在大鼠癫痫发作30 min后，立即腹腔注射地西泮(10 mg/kg)终止癫痫发作。Li-PILO+LEV组在成功建立模型后的4 h给予LEV 200 mg/kg，1次/d，连续28 d，动态观察并分别于第7、14、28天提取海马组织进行实验。

1.3Morris水迷宫实验将4组大鼠于癫痫模型建立7 d后进行实验，共持续4 d进行定位航行实验。空间探索实验：于第5天进行，撤去平台，将大鼠于水池中任意一点放入水中游泳，记录大鼠60 s内穿越平台的次数。

1.4RT-PCR法检测大鼠海马组织中5-HT2A受体的表达模型建立7、14、28 d后，分别将4组大鼠给予10%水合氯醛(0.1 ml/kg)麻醉后固定，断头取出海马组织并立即放在液氮中保存。海马组织匀浆后，加入Trizol液提取mRNA，按照试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA，将cDNA产物进行Real-time PCR循环。从NCBI库中搜索到5-HT2A受体应用Premier5.0引物设计软件设计引物。5-HT2A上游引物：5′GGTTTCCTT-GTCATGCCTGT 3′，下游：5′TGCAGGATTCTTTGCAGATG 3′；内参GAPDH上游：5′TGCTTCACCACCTTCTTGA 3′，下游：5′TCACCATCTTCCAGGAGCG 3′。扩增后进行琼脂糖凝胶电泳。

1.5统计学分析采用SPSS17.0软件进行方差分析、单因素方差分析和t检验。

2结果

2.1观察大鼠行为学表现匹罗卡品腹腔注射约5～10 min后，Li-PILO组和Li-PILO+LEV组大鼠出现癫痫发作，表现为面部抽动、点头、洗脸、前肢阵挛、跌倒以至全面性强直阵挛发作，其中Li-PILO组和Li-PILO+LEV组共有9只大鼠抽搐后死亡，癫痫发作30 min后立即给予地西泮(10 mg/kg)腹腔注射终止发作，在大鼠成功建立模型后Li-PILO组和Li-PILO+LEV组大鼠表现出易激惹，并可观察到Ⅰ～Ⅳ级的癫痫发作。

2.2LVE对认知功能的影响在定位航行实验中，与对照组比较，Li-PILO组的逃避潜伏期明显延长(P<0.05)；Li-PILO组与Li-PILO+LEV组比较，Li-PILO+LEV组的逃避潜伏期明显缩短(P<0.05)；LEV组和NS组比较差异无统计学意义(P>0.05)。空间搜索实验中，与对照组比较，Li-PILO组穿越平台的次数明显减少(P<0.05)；与Li-PILO组比较，Li-PILO+LEV组穿越平台次数显著增多(P<0.05)，见表1。

表1　LEV对大鼠认知功能的影响

与Li-PILO组比较：1)P<0.05

2.3各组大鼠海马组织中5-HT2A受体的表达NS组内各时间点5-HT2A受体表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；与NS组比较，Li-PILO组在第7天时大鼠海马组织中5-HT2A受体表达水平降低，且随时间延长5-HT2A受体表达水平明显降低，即在第14、28天，5-HT2A受体表达水平明显降低(P<0.05)；与Li-PILO组比较，Li-PILO+LEV组5-HT2A受体在第7、14、28天表达水平明显升高(P<0.05)，见表2、图1。

表2　海马组织中5-HT2A受体相对表达量的

与NS组比较:1)P<0.05；与Li-PILO组比较:2)P<0.05

A：Li-PILO+LEV组；B：Li-PILO组；C：NS组；D：LEV组 图1　PCR检测第14天各组大鼠海马组织中5-HT2A受体表达

3讨论

癫痫是小儿时期常见的神经系统疾病之一，其特点是自发、慢性、短暂、反复发作。癫痫可引起患儿的人格障碍、记忆力减退、智力低下等表现，尤其是在患儿的发育早期影响较大〔7〕。

5-羟色胺(5-HT)是一种吲哚衍生物，是重要的神经递质，其主要的作用有参与记忆和学习、情绪、食欲、体温调节、心血管功能、睡眠控制、性和致幻行为、调节内分泌和抑郁以及肌肉收缩等生理功能〔8〕。5-HT2A受体是5-HT受体的亚型之一。有研究报道5-HT2A受体与神经系统疾病密切相关，Berg等〔9〕研究发现神经系统受损时脑组织中5-HT2A受体数目明显减少。然而目前关于5-HT2A受体与癫痫的关系国内外暂无报道，而关于5-HT与癫痫的关系报道很多，5-HT在含有抑制性递质γ氨基丁酸的神经元上表达，从而激活γ氨基丁酸，间接地发挥其抗癫痫作用。本研究提示5-HT2A受体与癫痫有密切的关系，LVE的抗癫痫机制可能是通过升高5-HT2A的表达而发挥其抗癫痫作用。认知功能包括了学习和记忆的过程。海马是哺乳动物学习记忆的重要脑区，其损伤会导致学习记忆的障碍。癫痫发作会损伤海马，LEV可治疗癫痫，控制癫痫发作，减少海马损伤，改善学习记忆。LEV作为治疗小儿癫痫的药物，对认知功能无影响，是一种疗效好、安全性好的广谱抗癫痫药。何绘敏等〔10〕在左乙拉西坦对幼年癫痫大鼠空间学习记忆的影响中发现，与模型组比较，LEV组大鼠的逃避潜伏期明显缩短，LEV能够改善大鼠的学习记忆功能。本研究结果发现，在定位航行实验中癫痫模型组的逃避潜伏期明显延长，以上的结果显示LEV对癫痫大鼠的认知功能有一定的改善作用，LEV对正常大鼠空间学习记忆能力无损害作用，是安全性很好的抗癫痫药物。

4参考文献

1Loscher W，Brandt C.Prevention or modification of epileptogenesis after brain Insults：experimental approaches and translation research〔J〕.Pharmacol Rev，2010；62(4)：669-700.

2DiIorio CK，Bamps YA，Edwards AL，etal.The prevention research centers′ managing epilepsy well network〔J〕.Epilepsy Behav，2010；19(3)：218-24.

3Nowack A，Malarkey EB，Jia Y，etal.Levetiracetam reverses synaptic deficits produced by overexpression of SV2A〔J〕.PLoS One，2011；6(12)：1-8.

4Chung S，Wang N，Hank N.Comparative retention rates and long-term tolerability of new antiepileptic drugs〔J〕.Seizure，2007；16(4)：296-304.

5Sanchez PE，Zhu L，Verret L，etal.Levetiracetam suppresses neuronal network dysfunction and reverses synaptic and cognitive deficits in an Alzheimer′s disease model〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2012；109(42)：2895-903.

6梁益，孙红斌.氯化锂-匹罗卡品癫痫模型研究〔J〕.实用医学临床杂志，2008；5(3)：112-4.

7Hermann BP，Serdenerg M，Bel B，etal.The neurodevelopmental impact of childhood onset temporal lobe epilepsy on brain structure and function〔J〕.Epilepsia，2002；43(9)：1062-71.

8Berger M，Gray JA，Roth BL.The expanded biology of serotonin〔J〕.Ann Rev Med，2009；60(1)：355-66.

9Berg KA，Harvey JA，Spampinato U，etal.Physiological and therapeutic relevance of constitutive activity of 5-HT2A and 5-HT2C receptors for the treatment of depression〔J〕.Prog Brain Res，2008；172(3)：287-305.

10何绘敏，路晴，孙香梅，等.左乙拉西坦对幼年癫痫大鼠空间学习记忆及海马胶质原纤维酸性蛋白的影响〔J〕.儿科药学杂志，2011；17(4)：9-12.

〔2014-05-22修回〕

(编辑李相军/滕欣航)