TLR4在慢性支气管炎大鼠模型中对炎症损伤与黏液分泌的调控作用

TLR4在慢性支气管炎大鼠模型中对炎症损伤与黏液分泌的调控作用

万宁张建勇1

(宜宾市第一人民医院呼吸内科，四川宜宾644000)

摘要〔〕目的观察TLR4在细菌内毒素(LPS)致慢性支气管炎大鼠模型中对气道炎症损伤与黏液分泌的调控作用。方法SPF级雄性Wistar大鼠40只，随机分为正常对照组(NS组)、慢性支气管炎组(LPS组)、多粘菌素B干预组(LPS+PMB组)、多粘菌素B自身对照组(PMB组)，每组10只。用气管内注入LPS 200 μg/200 μl及每日LPS溶液雾化吸入1 h的方法建立慢性支气管炎动物模型，3 w后收集支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞学计数和白细胞分类检测，酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定BALF中肿瘤坏死因子(TNF)-α含量，对大鼠肺脏进行病理学检查，肺组织阿先蓝过碘酸雪夫(AB-PAS)阳染面积，用免疫组化法观察黏蛋白Muc5AC、TLR4在支气管肺内的表达及荧光定量RT-PCR Muc5AC mRNA、TLR4 mRNA在肺内的表达。结果LPS组大鼠BALF细胞总计数、中性粒细胞个数、TNF-α水平。AB-PAS阳染面积、Muc5AC、TLR4蛋白表达量及Muc5AC mRNA、TLR4 mRNA水平与LPS+PMB组比较有显著性差异(均P<0.05)，NS组和PMB无统计学差异(P>0.05)。结论TLR4介导LPS诱发的慢性呼吸道炎症反应可能导致Muc5AC 蛋白与mRNA高表达。多粘菌素B可能通过抑制肺组织TLR4 mRNA及其蛋白的表达而抑制气道黏液高分泌。

关键词〔〕慢性支气管炎；内毒素；多粘菌素B；TLR4；Muc5AC

中图分类号〔〕R562.2〔文献标识码〕A〔

基金项目：贵州省科技计划课题(黔科合SY字〔2008〕3056)

通讯作者：张建勇(1966-)，男，医学博士，主任医师，主要从事气道炎症及黏液高分泌研究。

1遵义医学院附属医院呼吸二科

第一作者：万宁(1979-)，女， 硕士，主治医师，主要从事慢性阻塞性肺疾病气道黏液高分泌性研究。

气道黏液高分泌是慢性气道疾病的重要特征，确切发生机制及调控目前尚不十分清楚。气道黏液高分泌的分子基础是气道主要黏蛋白(Muc)5AC的产生和分泌增加〔1〕，而细菌感染是慢性气道疾病发生发展或反复加重的重要因素，其中G-菌是最主要的致病菌之一，而脂多糖(LPS)则是G-菌感染的主要致病因子。本实验将探讨TLR4信号转导通路在细菌LPS诱导大鼠慢性支气管炎气道黏蛋白表达中的作用，为气道黏液高分泌的药物干预治疗提供新的思路。

1材料与方法

1.1慢性支气管炎模型建立与分组SPF级6～8周龄雄性Wistar大鼠40只(购自重庆第三军医大学大坪医院实验动物中心)，体重约220～240 g，随机分为正常对照组(NS组)、慢性支气管炎组(LPS组)、多粘菌素B干预组(LPS+PMB组)、多粘菌素B自身对照组(PMB组)，每组10只。参考Nie等〔2〕的方法，并作改进，建立大鼠慢性支气管炎模型：第1天气管内注入脂多糖(LPS)200 μg/200 μl(E.coli 055:B5，美国Sigma公司)后，每天在自制玻璃箱(50 cm×50 cm×40 cm)内雾化吸入(德国百瑞压缩吸入器，型号：085G1005)LPS溶液(50 μg/ml)1 h，连续3 w。NS组用NS代替LPS。LPS+PMB组：建立大鼠慢性支气管炎模型(方法同前)外，于每日雾化吸入前1 h给予腹腔注射PMB 1 mg/kg干预(美国Amresco)。PMB组：同正常对照组外，于每日雾化吸入前1 h给予腹腔注射PMB 1 mg/kg。

1.2肺组织标本和支气管肺泡灌洗液制备大鼠持续雾化吸入3 w后处死，取右上、中叶肺组织迅速放入-80℃冰箱保存，以备RNA提取。取右下叶肺组织放入4%多聚甲醛中固定。左肺行支气管肺泡灌洗获得BALF做细胞计数、白细胞分类和细胞因子肿瘤坏死因子(TNF)-α测定〔3〕。

1.3ELISA测定BALF细胞因子TNF-α采用ELISA双抗体夹心法，按试剂盒说明书进行检测(上海森雄科技实业有限公司)，酶标仪(ELX800，美国)在492 nm处测吸光度。

1.4AB-PAS染色肺组织石蜡切片，常规脱蜡至水，做AB-PAS染色，进行图片采集和相对着色面积定量分析。

1.5免疫组化法检测气道Muc5AC和肺组织TLR4的表达均采用二步法，Muc5AC一抗为小鼠抗Muc5AC单克隆抗体(SANTA公司)，鼠抗-Muc5AC抗体二步法试剂盒(北京中杉金桥生物公司)。TLR4一抗为羊抗大鼠TLR4多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，羊抗-TLR4抗体二步法试剂盒(北京中杉金桥生物公司)。均按试剂盒说明进行操作，以积分光密度(IOD)为指标进行定量分析。

1.6荧光定量RT-PCR检测肺组织Muc5AC和TLR4 mRNA表达。采用RNAiso Reagent试剂(TaKaRa公司)参照说明书提取各组大鼠肺组织总RNA，取0.5 μg RNA逆转录(逆转录试剂盒购自TaKaRa公司，DRR037S)，按试剂盒说明书合成cDNA。Muc5AC、TLR4及内参照β-actin的引物由TaKaRa公司设计合成，其序列见表1。按PCR反应试剂盒(TaKaRa公司，DRR041S)说明书进行PCR反应(ICycler iQ荧光定量PCR仪，美国BIO-RAD公司)，反应条件均为：95℃ 10 s；95℃ 5 s，62℃ 20 s，共40个循环。每一例样本反应结束后由计算机自动计算并读出定量结果Ct值。各组数据采用2-△△Ct法进行相对定量。

表1　Muc5AC、TLR4、β-actin引物序列

1.7统计学处理采用SPSS13.0软件行方差分析。

2结果

2.1HE染色结果NS组和PMB组大鼠支气管管壁及其周围组织结构完整而清晰，未见或偶见很少量炎性细胞。LPS组见支气管上皮细胞损伤脱落，杯状细胞明显增多，支气管壁及其周围组织和肺泡以中性粒细胞和巨噬细胞为主的大量炎性细胞浸润，炎症细胞浸润明显处可见管壁平滑肌束断裂，排列紊乱，管腔狭窄。与LPS组比较，LPS+PMB组大鼠上述病变明显减轻。

2.2BALF细胞计数和白细胞分类NS组和PMB组大鼠BALF白细胞总数和细胞分类无差异(P>0.05)，主要以巨噬细胞为主。LPS组BALF白细胞总数、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞均较NS组明显增多(均P<0.01)。LPS+PMB组细胞总数、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞与LPS组比较明显减少(均P<0.01)，而较NS组有所增加。见表2。

表2　各组大鼠BALF细胞计数变化

2.3BALF细胞因子TNF-α水平测定NS组〔(70.35±5.84)pg/ml〕和PMB组〔(71.01±3.47)pg/ml〕BALF中TNF-α水平无差异(P>0.05)，LPS组〔(172.91±4.16)pg/ml〕、LPS+PMB组〔(96.95±7.50)pg/ml〕BALF中TNF-α水平较NS组明显增高(P<0.01)，LPS+PMB组增高值较LPS组低(P<0.01)。

2.4气道AB-PAS染色AB-PAS染色结果显示：NS组和PMB组气道黏液物质染色无明显差别〔(1.54±0.12)%,(1.52±0.03)%〕(P>0.05)。LPS组、LPS+PMB组气道黏液物质相对着色面积〔(28.20±1.22)%,(13.30±1.49)%〕较NS组明显增高(P<0.01)。LPS+PMB组增高值较LPS组低(P<0.01)。

2.5免疫组化法检测气道Muc5AC和肺组织TLR4的表达Muc5AC表达于支气管管腔内，其余肺组织未见表达。NS组和PMB组Muc5AC表达低，且二者无差异(P>0.05)。LPS组可见大量Muc5AC表达，其IOD值明显高于NS组(P<0.01)。LPS+PMB组表达量较LPS组明显减低(P<0.01)，但仍高于NS组(P<0.01)。TLR4主要表达于支气管上皮、肺泡、血管壁等，均为膜表达。TLR4均在NS组和PMB组表达低，且无差异(P>0.05)。LPS组可见大量TLR4表达，其IOD值明显高于NS组(P<0.01)。LPS+PMB组表达量较LPS组明显减低(P<0.01)，但仍高于NS组(P<0.05)。见表3。

表3　各组大鼠气道Muc5AC和肺组织

与NS组比较：1)P<0.01，与LPS组比较：2)P<0.01；下表同

2.6荧光定量RT-PCR检测肺组织Muc5AC和TLR4 mRNA表达NS组和PMB组大鼠气道黏蛋白Muc5AC mRNA表达量低，且二者无差异(P>0.05)。LPS组较NS组表达明显增高(P<0.05)，LPS+PMB组表达量增高，但低于LPS组(P<0.05)。TLR4 mRNA在NS组和PMB组大鼠肺组织表达量低，且二者无差异(P>0.05)；LPS组较NS组明显增高(P<0.05)；LPS+PMB组表达量增高，但低于LPS组(P<0.05)。见表4。

表4　大鼠肺组织Muc5AC和TLR4 mRNA表达 ± s, n=10)

3讨论

气道黏液高分泌是影响慢性气道疾病如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、支气管哮喘及囊性纤维化等病情和预后的独立危险因素〔3，4〕。黏蛋白是气道黏液的最主要成分。研究证实，气道Muc在病理状态下主要表现为Muc5AC，气道Muc5AC含量及其转录水平代表慢性支气管炎患者气道黏液分泌强度〔5〕。

由于气道炎症反应及黏液分泌发生、发展与细菌感染有着直接的关系。G-菌是构成呼吸道感染的最关键致病菌，而LPS是决定G-菌致病力的关键霉素。TLR是LPS主要受体，其作用主要体现在免疫应答和炎性反应。人类气道上皮细胞存在TLR，其中TLR4主要分布于细胞基底膜。在LPS刺激下，可使TLR激活并通过TLRs信号通路介导多种生物学效应。

在LPS刺激下，气道上皮细胞的TLR水平升高，且主要是TLR4上调。LPS可诱使豚鼠气道上皮黏蛋白分泌增多和杯状细胞化生，铜绿假单胞菌脂多糖刺激NCI-H292细胞MUC5AC、TLR4基因表达和蛋白质的生产。向大鼠气管内滴入绿脓假单胞菌LPS，可引起大量中性粒细胞聚集以及广泛的气道上皮细胞型改变，蛋白分泌明显升高。本研究使用LPS成功搭建大鼠慢性支气管炎和气道黏液高分泌模型，进一步佐证了炎症细胞浸润程度决定气道黏液分泌量的内在关系。

作为TLR4最主要的配体，明确LPS与TLR4在慢性支气管炎发病中扮演的角色十分必要。本研究结果显示，LPS水平与TLR4 mRNA表达正相关；另外，低浓度LPS刺激后TLR4 mRNA表达上调，且肺组织炎症改变加重，气道阻力加大，气道壁厚度增加；但高浓度LPS刺激后虽然TLR4 mRNA表达上扬趋势更明显，但肺组织炎症却减轻，气道阻力和气道壁厚度均改善。由此说明，TLR4在参与支气管炎症发生和气道重组过程中发挥着重要角色。

通过本研究可以推测， TLR4信号通路介导的细菌LPS作用与气道黏蛋白Muc5AC的产生及其高表达之间可能存在必然联系。PMB通过对抗LPS，可能抑制气道Muc5AC、TLR4蛋白及Muc5AC mRNA、TLR4 mRNA表达。

4参考文献

1Ryan A,Smith A,Moore P,etal.Expression and Characterization of a novel recombinant version of the secreted human mucin MUC5AC nairway cell lines〔J〕.Biochemistry,2015;54(4):1089-99.

2Nie YC,Wu H,Li PB,etal.Characteristic comparison of three rat models induced by cigarette smoke or combined with LPS:to establish a suitable model for study of airway mucus hypersecretion in chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.Pulm Pharmacol Ther,2012;25(5):349-56.

3Mizuguchi Y1,Myojo T,Oyabu T,etal.Comparison of dose-response relations between 4-week inhalation and intratracheal instillation of NiO nanoparticles using polimorphonuclear neutrophils in bronchoalveolar lavage fluid as a biomarker of pulmonary inflammation〔J〕.Inhal Toxicol,2013;5(1):29-36.

4Rubin BK.Secretion properties,clearance,and therapy in airway disease〔J〕.Transl Respir Med,2014;10(3):2-6.

5Xu R,Li Q,Zhou X,etal.Annexin Ⅱ mediates the neutrophil elastase-stimulated exocytosis of mucin 5ac〔J〕.Mol Med Rep,2014;9(1):299-304.

〔2015-08-30修回〕

(编辑曲莉)