山银花绿原酸提取方法的比较

（湖南农业大学生物科学技术学院中草药与天然产物研究室，湖南长沙410128）

山银花为常用中药，具有清热解毒、凉散风热之功效［1］，同时山银花还是重要的化工原料和优良饮品原料［2］。山银花分布广，在我国西南、中南地区有大量栽培［3－5］。湖南邵阳、娄底、怀化等地区的山银花药材商品名为“湘银花”，其产量占全国山银花总产量的40%以上。

作者在此分别采用水提法、醇提法、酶解法、超声波法、微波法提取山银花中的绿原酸，并通过高效液相色谱测定绿原酸含量，比较各种方法的提取效果，以期为植物有效成分的提取提供帮助。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

山银花，湖南省隆回县小沙江镇金银花基地；纤维素酶；绿原酸。

无水乙醇、甲醇、磷酸等均为分析纯；乙腈为色谱纯；蒸馏水。

KQ3200E型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；THZ－92B 型台式恒温振荡器，上海浦东物理光学仪器厂；DK－S24型恒温水箱，上海精宏实验设备有限公司；中草药粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；AL204型电子天平，梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；SHZ－D（Ⅲ）型循环水式真空泵，巩义英峪予华仪器厂；R－1001N 型旋转蒸发仪，郑州长城科工贸有限公司；1200型高分离度快速液相色谱仪，安捷伦科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 山银花中绿原酸的提取

1）水提法

将山银花茎于60 ℃恒温干燥后用中草药粉碎机粉碎。精确称取5g干燥的山银花粉末于100mL 锥形瓶中，分别用10 倍量、10 倍量、8 倍量的蒸馏水于70 ℃煎煮3次，每次1h。合并煎煮液，抽滤，取滤液于60℃减压浓缩至干，置于恒温干燥箱中干燥至恒质量，得绿原酸粗提物。

2）醇提法

精确称取5g干燥的山银花粉末于250mL 圆底烧瓶中，加75%乙醇，分别用10 倍量的75%乙醇于80 ℃下加热回流提取2次，每次1h。合并提取液，抽滤，取滤液于60 ℃减压浓缩至干，置于恒温干燥箱中干燥至恒质量，得绿原酸粗提物。

3）酶解法

精确称取0.5g纤维素酶（2 000IU·g－1）定容于100mL容量瓶中配制成0.5%纤维素酶液。精确称取5g干燥的山银花粉末于100 mL 锥形瓶中，加入10倍量0.5%纤维素酶液处理15 min，迅速高温灭活，将处理液分别用10倍量60%乙醇和10倍量蒸馏水于80℃加热回流提取2次，每次1h。合并提取液，抽滤，取滤液于60 ℃减压浓缩至干，置于恒温干燥箱中干燥至恒质量，得绿原酸粗提物。

4）超声波法

精确称取5g干燥的山银花粉末于100mL 锥形瓶中，加入12 倍量蒸馏水，在超声波清洗器中处理0.5h，再分别用10倍量、10倍量、8倍量的蒸馏水于70 ℃煎煮3次，每次1h。合并煎煮液，抽滤，取滤液于60℃减压浓缩至干，置于恒温干燥箱中干燥至恒质量，得绿原酸粗提物。

5）微波法

精确称取5g干燥的山银花粉末于100mL 锥形瓶中，先用少量乙醇润湿，再加入1.25倍量的75%乙醇，用微波快速汽化处理70s后，用25倍量的90 ℃水洗涤10min，再用水提法提取得绿原酸粗提物。

1.2.2 绿原酸标准品的高效液相色谱（图1）

图1 绿原酸标准品的高效液相色谱Fig.1 The HPLC of chlorogenic acid standard

HPLC 条件：流动相为乙腈－0.4%磷酸（23∶77，体积比），流速为1mL·min－1，柱温30 ℃，检测波长324nm，理论塔板数按绿原酸峰计算应不低于1 000。

1.2.3 绿原酸提取率的测定

将绿原酸粗提物置于50mL容量瓶中，用50%甲醇定容，摇匀；再稀释50 倍，用50%甲醇定容，摇匀；0.45μm 滤膜过滤，备用。用流动相将柱子洗脱干净后，进样5μL绿原酸标准品进行校正。取待测样品5 μL进样，测得各样品的峰面积。根据标样浓度以及样品峰和标样峰的面积比可求得各提取液中绿原酸含量，按下式计算绿原酸提取率：

2 结果与讨论

2.1 提取效果比较

采用5种方法提取山银花中的绿原酸，比较各方法所得绿原酸含量和提取率，结果见图2。

由图2可知，酶解法、超声波法、微波法均能不同程度提高山银花中绿原酸提取率，其中微波法提取率最高，醇提法提取率最低。具体比较如下：

（1）水提法提取率为4.51%，醇提法提取率为3.14%，水提法提取率明显高于醇提法，且相对于醇提法，水提法药品消耗量少、步骤简单。这是因为，绿原酸的水溶性好，易溶于热水，在25 ℃水中的溶解度约为4%，故水提法提取率高于醇提法。

图2 不同方法所得绿原酸含量（a）和提取率（b）比较Fig.2 Comparison of content（a）and extraction rate（b）of chlorogenic acid by different methods

（2）醇提法和酶解法均是在80℃下用乙醇加热回流提取2次，醇提法提取率为3.14%，酶解法提取率为4.14%，酶解法提取率明显高于醇提法。这是因为，山银花用纤维素酶处理后，细胞壁中结构致密的纤维素水解成水溶性糖类物质，有利于胞内物质（绿原酸）溶出，绿原酸提取率相应提高。如能控制好酶处理温度及作用时间则能大幅提高山银花中绿原酸提取率。酶解法操作简便、提取物纯度高、无有机溶剂残留，但生产成本较高，其可行性有待进一步研究。

（3）超声波法提取率为4.62%。超声波能击碎细胞壁，使细胞内组分渗透到溶液中，从而达到分离的目的。该法提取率高、综合成本低、污染小、易过滤，无醇提法中因溶剂使用带来的不利。但山银花经超声波处理后呈糊状黏稠，不利于后续操作，不适合工业化生产，其可行性有待进一步研究。

（4）微波法提取率为4.69%。与超声波法相比，微波法不仅提取率高、提取时间短，且重复性好，可用于植物有效成分的快速分析，但操作步骤繁琐，不适宜大量样品的处理。

2.2 方差分析（表1，表2）

表1 5种方法提取率的描述性指标Tab.1 The descriptive index of extraction rate by five methods

表2 5种方法提取率的两两比较（LSD法）Tab.2 The binary comparison of extraction rate by five methods（LSD method）

由表2可知，以LSD 法作均数进行两两比较的结果为：水提法与醇提法、酶解法之间存在显著性差异（具有统计学意义）；醇提法与水提法、酶解法、超声波法、微波法之间存在显著性差异；酶解法与水提法、醇提法、超声波法、微波法之间存在显著性差异；超声波法与醇提法、酶解法之间存在显著性差异；微波法与醇提法、酶解法之间存在显著性差异。

2.3 讨论

（1）酶解法、超声波法、微波法均能不同程度提高山银花中绿原酸提取率，其中提取率最高的是微波法，酶解法和超声波法也能得到较高的提取率，但只适合提取少量样品，不适合大规模的工业化生产，其可行性有待进一步研究。

（2）绿原酸的邻二酚羟基结构不稳定，高温加热易氧化分解，因此，高温及长时间加热不利于山银花中绿原酸的提取。在碱性条件下，绿原酸可发生水解，在提取纯化时也应予以注意。绿原酸分子中含有5个羟基和1个羧基，在水中溶解度达4%，因此，从经济、适用和安全角度出发，大量提取山银花中绿原酸时，多以水为溶剂。

3 结论

分别采用水提法、醇提法、酶解法、超声波法、微波法提取山银花中绿原酸，提取率大小依次为：微波法（4.69%）＞超声波法（4.62%）＞水提法（4.51%）＞酶解法（4.14%）＞醇提法（3.14%）。可以看出：水提法、醇提法、酶解法、超声波法、微波法均能不同程度提取山银花中绿原酸，其中微波法提取率最高，醇提法提取率最低。

［1］张英华，陈新，张国飞，等.芪冬颐心口服液中绿原酸的含量测定［J］.长春中医学院学报，1998，14（3）：52.

［2］张华年，杨少芳，陈继业，等.HPLC 同时测定双黄连注射液中绿原酸和黄芩苷2种指标成分含量［J］.中国现代应用药学，1999，16（6）：47－49.

［3］周日宝，贺又舜，罗跃龙.湖南省大宗道地药材的资源概况［J］.世界科学技术：中医药现代化，2003，5（2）：71－74.

［4］苟占平，万德光.四川忍冬属药用植物资源调查［J］.华西药学杂志，2005，20（6）：480－482.

［5］苟占平，万德光.重庆忍冬属药用植物资源研究［J］.贵阳中医学院学报，2005，27（4）：10－11.