新鲜蛹虫草中SOD的提取工艺优化

（广东海洋大学理学院，广东湛江524088）

蛹虫草（Cordycepsmilitaris），又称京都蛹虫草、北虫草，是虫、草结合的药、食用真菌［1］，具有增强免疫力及抗病功效，其食用、药用价值可与冬虫夏草媲美。

超氧化物歧化酶（SOD）是广泛存在于生物体内的金属酶，不仅能清除生物体内超氧阴离子自由基［2］、降低机体内过氧化脂质的生成速度［3］，而且具有消炎及防辐射等功能［4］。因此，SOD 的提取受到研究者的广泛关注。作者在此以酶活力为考核指标，通过单因素实验和正交实验对新鲜蛹虫草中SOD 的提取工艺进行优化，拟为蛹虫草的进一步开发利用奠定基础。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

新鲜蛹虫草，购于江苏。

三羟甲基氨基甲烷、碳酸钠、磷酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、考马斯亮蓝、硫酸铵、邻苯三酚，分析纯，上海试剂厂。

PHS－3C型酸度计；超声波清洗机，新芝生物科技股份有限公司；电子分析天平、UV－2550型紫外分光光度计，日本岛津公司；TDZ5型低速台式自动平衡离心机，赫西仪器装备有限公司。

1.2 新鲜蛹虫草中SOD 的提取工艺流程

新鲜蛹虫草→研磨→超声波提取→离心分离→粗提液→离心分离→SOD 粗酶液→纯化

称取0.5g新鲜蛹虫草，研磨，放入烧杯中，加入0.05mol·L－1pH 值为7.8的磷酸缓冲溶液20mL；置于超声波清洗机内破壁提取20min后，于离心机中以10 000 r·min－1离心20 min，取上清液，加（NH4）2SO4固体至饱和度达到42%，再以10 000r·min－1离心10 min，得粗酶液，于冰箱中5 ℃储存备用。

1.3 提取工艺优化

以粗酶液中SOD 的酶活力为考核指标，先固定新鲜蛹虫草用量，研究磷酸缓冲溶液用量及pH 值、超声提取时间、（NH4）2SO4饱和度4个因素对提取效果的影响；再在单因素实验的基础上，进行L9（34）正交实验，以优化新鲜蛹虫草中SOD 的提取工艺条件。

1.4 SOD 酶活力测定［5］

酶活力单位定义：将在1mL反应液中1min抑制邻苯三酚自氧化速率达50% 时的酶量定义为一个酶活力单位（U·mL－1）：

酶活力＝［（（A0－A1）／A0）／50%］×（Va／V0）×（n／Ve）

式中：A0为对照管吸光度（自氧化速率）；A1为测定管吸光度（加入酶后的氧化速率）；n为稀释倍数；V0为定义体积，1mL；Va为反应总体积，mL；Ve为加入酶体积，mL。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 磷酸缓冲溶液pH 值对SOD 酶活力的影响

取新鲜蛹虫草0.5g，固定磷酸缓冲溶液用量为20mL，超声提取20min，于10 000r·min－1离心20 min，考察磷酸缓冲溶液pH 值（5.0、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、9.0）对SOD 酶活力的影响，结果见图1。

图1 磷酸缓冲溶液pH 值对SOD酶活力的影响Fig.1 Effect of pH value of phosphate buffer solution on enzyme activity of SOD

由图1可看出，随着磷酸缓冲溶液pH 值的增大，SOD 酶活力先升高后降低，在pH 值为7.8 时，酶活力达到最高。因此，磷酸缓冲溶液pH 值选择7.8较为适宜。

2.1.2 磷酸缓冲溶液用量对SOD 酶活力的影响

取0.5g新鲜蛹虫草，在pH 值为7.8、不同用量（10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL、35 mL、40 mL、45mL、50mL）磷酸缓冲溶液中超声提取20min，于10 000r·min－1离心20min，考察磷酸缓冲溶液用量对SOD 酶活力的影响，结果见图2。

图2 磷酸缓冲溶液用量对SOD酶活力的影响Fig.2 Effect of dosage of phosphate buffer solution on enzyme activity of SOD

由图2 可看出，随着磷酸缓冲溶液用量的增加，SOD酶活力先升高后降低，在用量为30mL 时，酶活力达到最高。因此，磷酸缓冲溶液用量选择30mL 较为适宜。

2.1.3 超声提取时间对SOD 酶活力的影响

取0.5g新鲜蛹虫草，在30 mL pH 值为7.8 的磷酸缓冲溶液中超声提取不同时间（0 min、5 min、10min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min），于10 000r·min－1离心20 min，考察超声提取时间对SOD 酶活力的影响，结果见图3。

图3 超声提取时间对SOD 酶活力的影响Fig.3 Effect of ultrasonic extraction time on enzyme activity of SOD

由图3 可看出，随着超声提取时间的延长，SOD 酶活力先升高后降低，在超声提取时间为20 min时，酶活力达到最高。因此，超声提取时间选择20 min较为适宜。

2.1.4 （NH4）2SO4饱和度对SOD 酶活力的影响

取0.5g新鲜蛹虫草，在30 mL pH 值为7.8的磷酸缓冲溶液中超声提取20 min，于10 000r·min－1离心20min，再加入不同饱和度（10%、20%、30%、35%、42%、45%、50%、55%）（NH4）2SO4后，于10 000r·min－1离心10min，考察（NH4）2SO4饱和度对SOD 酶活力的影响，结果见图4。

图4 （NH4）2SO4饱和度对SOD酶活力的影响Fig.4 Effect of（NH4）2SO4saturation on enzyme activity of SOD

由图4可看出，随着（NH4）2SO4饱和度的增大，SOD 酶活力先升高后降低，在（NH4）2SO4饱和度为42%时，酶活力达到最高。因此，（NH4）2SO4饱和度选择42%较为适宜。

2.2 正交实验

以SOD 酶活力为考核指标，选择磷酸缓冲溶液用量（A）、磷酸缓冲溶液pH 值（B）、超声提取时间（C）、（NH4）2SO4饱和度（D）为考察因素，进行L9（34）正交实验进一步优化SOD 提取工艺。正交实验因素与水平见表1，结果与分析见表2。

表1 正交实验因素与水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交实验结果与分析Tab.2 Results and analysis of orthogonal experiment

由表2可知，各因素对SOD 酶活力的影响大小依次为磷酸缓冲溶液用量＞超声提取时间＞（NH4）2SO4饱和度＞磷酸缓冲溶液pH 值，最优提取条件为A2B3C2D2，即新鲜蛹虫草0.5g、磷酸缓冲溶液用量20mL、磷酸缓冲溶液pH 值8.0、超声提取时间20 min、（NH4）2SO4饱和度42%，在此条件下，SOD 酶活力达到最高。

3 结论

以酶活力为考核指标，对新鲜蛹虫草中超氧化物歧化酶（SOD）的提取工艺进行了优化，通过单因素实验和L9（34）正交实验确定新鲜蛹虫草中SOD 的最佳提取条件为：新鲜蛹虫草用量0.5g、磷酸缓冲溶液用量20mL、磷酸缓冲溶液pH 值8.0、超声提取时间20 min、（NH4）2SO4饱和度42%，在此条件下，SOD 酶活力最高。

［1］邵力平，沈瑞祥，张素轩，等.真菌分类学［M］.北京：中国林业出版社，1984：109－123.

［2］徐锦堂.中国药用真菌学［M］.北京：中国协和医科大学及北京医科大学联合出版社，1997：394－401.

［3］敬一兵.虫草［M］.云南：云南科学技术出版社，1986：17－35.

［4］俞纯方，吴建生，张荣强，等.兔血SOD 的提取及活性研究［J］.西南农业大学学报，1995，17（5）：478－480.

［5］黄维嘉，陈宏础，黄天禄.邻苯三酚自氧化抑制法测定人红细胞超氧化物歧化酶［J］.中华医学检验杂志，1989，12（4）：206－208.