紫外－氯化锂复合诱变选育高产α－淀粉酶菌株

（中国药科大学生命科学与技术学院，江苏南京210009）

α－淀粉酶（α－1，4－葡聚糖－4－葡聚糖水解酶，EC3.2.1.1）属于内切酶，它能作用于淀粉分子内部的α－1，4糖苷键，将其水解成糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等［1］。α－淀粉酶作为酶制剂的重要组成部分，占酶制剂市场约25%的份额，广泛应用于食品、发酵、纺织、造纸、制药以及临床医学等多个领域［2］。伴随国内外淀粉加工业的不断发展，α－淀粉酶的应用范围还在不断扩大［2］。因此，筛选高产α－淀粉酶菌株已成为酶制剂研究领域的重要方向。

野生菌株因产率低、性能差而不能直接用于工业化生产，需要通过菌种诱变选育出高产优良菌株［3－7］。不同的诱变方法对菌株会产生不同的突变效应，如紫外诱变可使DNA 形成嘧啶二聚体，氯化锂诱变可使AT－GC碱基对发生转换或导致碱基缺失［8－9］。单一诱变方法虽可得到高产菌侏，但几率偏低；复合诱变具有协同效应，比单一诱变效果好［10］。鉴于此，作者在此采用紫外－氯化锂对枯草芽孢杆菌BL01 进行复合诱变，以期得到高产α－淀粉酶菌株，对诱变条件进行了优化，并对高产菌株的遗传稳定性进行了研究。

1 实验

1.1 菌株与培养基

枯草芽孢杆菌BL01，自行筛选保藏。

LB培养基：蛋白胨10g·L－1，酵母提取物5g·L－1，氯化钠10g·L－1，pH 值7.0，121 ℃灭菌20 min。固体培养基需加入20g·L－1的琼脂；筛选培养基需加入1%可溶性淀粉；氯化锂平板培养基需加入一定浓度的氯化锂。

发酵培养基：可溶性淀粉60g·L－1，豆饼粉30g·L－1，（NH4）2SO45g·L－1，Na2HPO4·12H2O 5g·L－1，MgSO4·7H2O 0.1g·L－1，NaCl 0.1g·L－1，pH 值7.0，121 ℃灭菌20min。

1.2 培养条件

斜面／平板培养：37 ℃培养箱中培养1～2d。

种子液培养：挑单菌落接种到30 mL LB 培养基中，于37 ℃、200r·min－1摇床培养12h。

发酵液培养：摇瓶装量50 mL·（500 mL）－1，接种量2%，于37 ℃、200r·min－1摇床培养96h。

1.3 诱变方法

1.3.1 菌悬液的制备

从平板上挑取单菌落于LB液体培养基中，37℃、200r·min－1摇床培养12h，用生理盐水稀释至10－5数量级，即得菌悬液。

1.3.2 紫外诱变

取5mL菌悬液于直径为9cm 的无菌培养皿中，待用。打开紫外灯，预热20min，待光波稳定后，将无菌培养皿放置在距紫外灯垂直距离20cm 处，开启磁力搅拌，分别照射30s、60s、90s、120s、150s、180s，于37 ℃避光培养。以未经处理的菌悬液为对照组。挑取20个单菌落进行摇瓶培养，按式（1）、（2）计算致死率与正突变率。

1.3.3 氯化锂诱变

取0.1mL菌悬液均匀涂布于含浓度梯度为0%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%的氯化锂平板培养基上，37 ℃恒温培养20h。其中0%为对照组。挑取20个单菌落进行摇瓶培养，按式（1）、（2）计算致死率与正突变率。

1.3.4 紫外－氯化锂复合诱变

将菌悬液先经紫外照射一段时间后，再涂布在含一定浓度的氯化锂平板培养基上，37 ℃避光培养。挑取30个单菌落进行摇瓶培养，按式（1）、（2）计算致死率与正突变率。

1.4 筛选方法

1.4.1 初筛

将诱变后的菌液涂布于筛选培养基上培养24h，测量透明圈直径与菌落直径，并计算其比值（HC 值），将HC值较大的单菌落保存于斜面培养基，以备复筛。

1.4.2 复筛

将初筛获得的菌株先进行种子液培养，再进行发酵液培养，取上清，按QB／T 1803－93方法测定α－淀粉酶酶活。

酶活定义：将1mL液体酶在pH 值为6.0、60 ℃下，1h液化1g可溶性淀粉定义为一个酶活单位（U·mL－1）。

1.5 遗传稳定性研究

将出发菌株与复筛得到的高产菌株各连续传代5代，每代重复3次，接入发酵培养基中，37 ℃、200r·min－1摇瓶培养96h后，离心，取上清，测定α－淀粉酶酶活，考察高产菌株传代后产α－淀粉酶能力的稳定性。

2 结果与讨论

2.1 紫外照射时间的选择（图1）

由图1可看出：随着紫外照射时间的延长，致死率逐渐升高、正突变率先升高后略微降低；当紫外照射时间为150s时，致死率达到90.4%，正突变率达到最高值25.0%；酶活提高10%以上的菌株有4株。因此，选择最佳紫外照射时间为150s较为适宜。

2.2 氯化锂浓度的选择（图2）

图1 紫外诱变的致死率与正突变率Fig.1 Death rate and positive mutation rate of UV mutation

图2 氯化锂诱变的致死率与正突变率Fig.2 Death rate and positive mutation rate of LiCl mutation

由图2可看出：随着氯化锂浓度的增大，致死率逐渐升高、正突变率逐渐降低；当氯化锂浓度为0.3%时，致死率为49.2%，正突变率最大，为19.4%；酶活提高10%以上的菌株有3株。因此，选择氯化锂浓度为0.3%较为适宜。

2.3 紫外－氯化锂复合诱变

在紫外照射时间为150s、氯化锂浓度为0.3%的条件下进行紫外－氯化锂复合诱变。

结果发现，致死率可达到96.3%，正突变率也达到了37.1%，比单一诱变效果要好。

2.4 高产菌的筛选

诱变后的单菌落在筛选平板上培养后形成淀粉圈，挑取10个单菌落进行摇瓶发酵，研究HC 值与酶活的关系，结果如表1所示。

由表1可知，HC 值的大小在一定程度上反映了菌株产α－淀粉酶的能力，HC值越大，产酶能力越强。

以枯草芽孢杆菌BL01 为出发菌株，经过多次复合诱变，初筛出HC 值较大的100 株突变株，再经复筛、发酵后测定酶活。结果发现，有58株突变菌的酶活比原始菌株提高，将其中一株酶活高且产酶稳定的菌株命名为BL01－13。该高产菌株诱变后酶活达到357.70U·mL－1，是出发菌株的2.02倍。

表1 HC值与酶活的关系Tab .1 The relationship between HC value and enzyme activity

2.5 高产菌株的遗传稳定性（表2）

表2 高产菌株的遗传稳定性（n＝3）Tab.2 Genetic stability of high－producing strain（n＝3）

由表2可知，高产菌株具有良好的遗传稳定性，传代5代后，酶活稳定在（357.73±4.06）U·mL－1范围内。

3 结论

采用紫外－氯化锂对产α－淀粉酶菌株枯草芽孢杆菌BL01进行复合诱变，在紫外照射时间为150s、氯化锂浓度为0.3%的最佳诱变条件下，经过淀粉圈初筛、发酵复筛，得到一株高产菌BL01－13，酶活达到357.70U·mL－1，是出发菌株的2.02倍，该菌遗传稳定性良好，为淀粉酶产品的开发与应用奠定了基础。

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