金银花耐缺氧活性部位的HPLC指纹图谱研究

（中国医科大学药学院天然药物化学教研室，辽宁沈阳110122）

金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬（LonicerajaponicaThunb.）的干燥花蕾或带初开的花，性寒味甘，具有清热解毒、凉风散热的功效，为临床常用中药之一［1－3］，主要含有环烯醚萜类［4］、有机酸类［5］、黄酮类［6］等化学成分。在研究金银花防治心血管疾病活性成分时发现，金银花药材经水提醇沉、D101大孔吸附树脂梯度洗脱，所得的30%乙醇－水洗脱部位能够延长异丙肾上腺素攻击后小鼠缺氧存活时间，提示其为金银花提高小鼠心肌细胞耐缺氧能力的活性部位。对活性部位的进一步研究表明，其中的咖啡酰奎宁酸类成分具有较好的心肌细胞保护作用。文献报道的金银花指纹图谱多集中于对药材提取物和抗炎活性部位的研究，未见防治心血管疾病相关活性部位的HPLC 指纹图谱研究。

鉴于此，作者采用HPLC 法，以咖啡酰奎宁酸类成分的最大吸收波长330nm 作为检测波长，对收集的10批金银花药材的耐缺氧活性部位HPLC 图谱进行分析比较，建立指纹图谱共有模式，为金银花防治心血管疾病相关活性部位入药提供质量评价依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

10批产地分别为山东、河南、河北的金银花药材（批号分别为：100902，100903，100906，100910，100912，100913，100916，100917，100918，100920）。

对照品：绿原酸（批号：110753－200413），中国药品生物制品检定所；反式咖啡酸、3，4－二咖啡酰奎宁酸、3，5－二咖啡酰奎宁酸、4，5－二咖啡酰奎宁酸（经核磁共振波谱和质谱鉴定，采用不加校正因子的主成分自身对照法检测，纯度均大于98%），自制。

甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、95%乙醇（分析纯），山东禹王有限公司；三氟乙酸（TFA，色谱纯），北京迪马科技有限公司；纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司；D101大孔吸附树脂，南开大学化工厂。

Agilent 1200分析型高效液相色谱仪（包括四元泵、在线脱气机、柱温箱、DAD 检测器、全自动进样器），美国Agilent公司；BT124S型电子天平，北京赛多利斯有限公司；FDU－1200型冷冻干燥机，东京理化器械株式会社；ZDHW 型调温电热套，北京中兴伟业有限公司。

1.2 色谱条件

色谱柱：分析型Shimadzu Shim－pack PREP ODS（H）C18（250 mm×4.60 mm，5μm）；检测波长330 nm；进样量15μL；柱温30 ℃；流速1.0mL·min－1；梯度洗脱60min。线性梯度洗脱程序见表1。

1.3 方法

1.3.1 对照品混合溶液的配制

表1 线性梯度洗脱程序Tab.1 Linear gradient elution program

取绿原酸、反式咖啡酸、3，4－二咖啡酰奎宁酸、3，5－二咖啡酰奎宁酸、4，5－二咖啡酰奎宁酸对照品适量，精密称定，加50%甲醇配制成绿原酸、反式咖啡酸、3，4－二咖啡酰奎宁酸、3，5－二咖啡酰奎宁酸、4，5－二咖啡酰奎宁酸浓度（mmol·L－1）分别为0.240、0.268、0.071、0.089、0.108的对照品混合溶液。

1.3.2 活性部位供试品溶液的制备

取金银花干燥药材50g，加入400 mL 水浸泡过夜，加热回流提取2次，每次3h，合并提取液，减压浓缩至50mL，边搅拌边加入95%乙醇150mL，静置过夜，抽滤，将滤液浓缩至无醇味，浓缩液经D101大孔吸附树脂柱色谱分离，乙醇－水梯度洗脱，收集30%乙醇－水洗脱部位，浓缩，冻干，得到冻干粉。取冻干粉约20mg，精密称定，溶于50%甲醇中，定容至5 mL，摇匀，即得活性部位供试品溶液。

1.3.3 测试方法

将10批产地不同的金银花药材按1.3.2方法制备活性部位供试品溶液，按1.3.1方法配制对照品混合溶液。精密量取对照品混合溶液和活性部位供试品溶液各15μL，按色谱条件测定高效液相色谱。

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

2.1.1 精密度实验

取批号为100902的药材冻干粉，制备活性部位供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图，以绿原酸的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，相对保留时间和相对峰面积的RSD 均小于3%，表明精密度良好。

2.1.2 稳定性实验

取批号为100902的药材冻干粉，制备活性部位供试品溶液，分别在制备后0h、4h、8h、12h、16h、24h进样，记录色谱图，以绿原酸的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，相对保留时间和相对峰面积的RSD 均小于3%，表明稳定性良好。

2.1.3 重复性实验

分别称取批号为100902的药材冻干粉6份，制备活性部位供试品溶液，进样测定，记录色谱图，以绿原酸的保留时间和峰面积为参照，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，相对保留时间和相对峰面积的RSD 均小于3%，表明重复性良好。

2.1.4 检测时间延长实验

2倍时间色谱图中1h 以后没有色谱峰，说明样品出峰完全。

2.2 指纹图谱及技术参数

2.2.1 指纹图谱的选择及特征峰的标定

采用相对保留时间标定共有指纹峰，其中色谱峰2（绿原酸）分离度良好，峰位居中，峰面积较大而且稳定。因此，选取绿原酸为参照峰（S），将其余指纹峰的保留时间与同一图谱中的参照峰（设定为1）进行比较，其比值为各指纹峰的相对保留时间。通过色谱图的叠加比较，得到10 批金银花活性部位的8 个共有峰，如图1所示。

图1 10批金银花活性部位的高效液相色谱叠加图Fig.1 HPLC Overlapping chromatograms for 10batches of active fraction fromFlos Lonicerae

通过与对照品对照，指认了其中5个共有峰分别为：绿原酸（S峰）、反式咖啡酸（4号峰）、3，4－二咖啡酰奎宁酸（6号峰）、3，5－二咖啡酰奎宁酸（7号峰）、4，5－二咖啡酰奎宁酸（8号峰），如图2所示。

利用“中药指纹图谱计算机辅助相似度评价软件（2010版）”处理，得到金银花活性部位的指纹图谱，如图3所示。

2.2.2 共有峰相对保留时间及相对峰面积（表2）

2.2.3 非共有峰面积

计算了10批供试品溶液指纹图谱中非共有峰面积及占总峰面积的百分比。结果显示，非共有峰的峰面积占总峰面积的百分比小于10%，符合指纹图谱有关要求。

图2 混合对照品溶液的高效液相色谱Fig.2 HPLC Chromatograms of the mixing solution of reference substances

图3 金银花活性部位的指纹图谱Fig.3 Fingerprint of active fraction from Flos Lonicerae

表2 10批金银花活性部位指纹图谱中共有峰的相对保留时间及相对峰面积Tab.2 Relative retention time and relative areas of common peaks for 10batches of active fraction fromFlos Lonicerae in fingerprint

2.2.4 金银花药材指纹图谱的相似度评价（表3）

由表3可知，金银花药材指纹图谱的相似度均大于0.98。说明这10批金银花药材的化学组成一致性较好，质量稳定。

2.3 讨论

2.3.1 色谱柱的选择

考察了Phenomenex Gemini C18（250mm×4.60 mm，5μm）、YMC－Pack ODS－A（250mm×4.60mm，5μm）、Shimadzu Shim－pack PREP ODS（H）C18（250 mm×4.60mm，5μm）3 种不同型号色谱柱的分离效果。结果表明，3种色谱柱的分离度相差不大，Shimadzu Shim－pack PREP ODS（H）C18（250mm×4.60mm，5 μm）的峰形更尖锐一些，不易拖尾。因此，选用Shimadzu Shim－pack PREP ODS（H）C18（250mm×4.60 mm，5μm）作为色谱柱。

表3 10批金银花指纹图谱的相似度分析Tab.3 Similarity analysis of fingerprints for 10 batches of Flos Lonicerae

2.3.2 流动相的选择

在流动相的筛选中，尝试等浓度洗脱的可行性。结果发现，等浓度洗脱分离时间较长，分离效果远不及梯度洗脱，故选用梯度洗脱。

分别选用甲醇－水、乙腈－水、甲醇－0.5‰TFA 水溶液、乙腈－0.5‰TFA 水溶液4种体系作为流动相。结果发现，采用乙腈－0.5‰TFA 水溶液作流动相时，各峰分离度较好，且基线平稳，有利于指纹图谱的分析。可能是由于组分中含有咖啡酰奎宁酸类物质，具有一定的酸性，需在流动相中加入少量的酸，从而改善各色谱峰之间的分离度。因此，选用乙腈－0.5‰TFA 水溶液作为流动相。

2.3.3 检测波长的选择

研究表明，咖啡酰奎宁酸类物质具有较好的心肌细胞保护作用，因此，以咖啡酰奎宁酸类物质的最大吸收波长330nm 作为检测波长，能使活性成分得到充分体现，且分离度较好。在其它波长下，咖啡酰奎宁酸类物质吸收值较小，而且受其它成分峰的干扰，分离度不好。因此，选用330nm 作为检测波长。

3 结论

采用水提醇沉、D101大孔吸附树脂梯度洗脱，富集金银花中提高小鼠心肌细胞耐缺氧能力的活性部位，建立了HPLC测定金银花耐缺氧活性部位指纹图谱的方法，以咖啡酰奎宁酸类物质的最大吸收波长330nm 作为检测波长，对收集的10批金银花药材的耐缺氧活性部位HPLC图谱进行分析比较，建立指纹图谱共有模式，对其中的共有峰进行了指认，为金银花防治心血管疾病相关活性部位入药提供质量评价依据。

［1］南京中医药大学.中药大辞典［M］.上册.上海：上海科学技术出版社，2006：1403－1405.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：205－206.

［3］宋卫霞.金银花水溶性化学成分研究［D］.咸阳：陕西中医学院，2008.

［4］KAKUDA R，IMAI M，YAOITA Y，et al.Secoiridoid glycosides from the flower buds ofLonicerajaponica［J］.Phytochemistry，2000，55（8）：879－881.

［5］张宇平，黄可龙.高效液相色谱法同时测定金银花中5种有机酸［J］.分析试验室，2007，26（7）：67－70.

［6］KUMAR N，SINGH B，BHANDARI P，et al.Biflavonoids fromLonicerajaponica［J］.Phytochemistry，2005，66（23）：2740－2744.