正交型发光二极管诱导荧光检测器的研制

（北京理工大学，北京100081）

荧光检测技术具有灵敏度高、选择性强的特点，其中激光诱导荧光检测器（laser induced fluorescence detection，LIFD）采用方向性和单色性能极佳的激光作为激发光源，能够达到超高的检测灵敏度（10－13mol·L－1）［1］。在基质复杂的生物样品分析中，只有自发荧光或荧光衍生化的物质能够产生荧光信号，可以有效降低甚至消除基质对检测结果的干扰，具有很高的选择性。

然而，激光诱导荧光检测器的小型化对于研究人员来说却是一个重大的挑战。商品化仪器主要用传统的气体激光器，具有价格昂贵、体积大、功耗高的缺点［2］，严重限制其广泛应用，半导体激光器的采用使这一情况有所改善，但并未从根本上解决这一问题。另外，为了降低背景噪声，提高检测灵敏度，常规激光诱导荧光检测装置都配备了复杂的光学系统，导致其体积非常庞大，也很难满足小型化的要求，因此，采用低功耗的激发光源并简化光路设计已经受到越来越多研究人员的重视。近年来，一些低功耗、小型化的激发光源逐渐应用到了荧光检测中［3－6］。发光二极管（lightemitting diode，LED）具有价格低、功耗低、体积小、可选波长范围宽、寿命长等优点［2，7－9］，可以实现仪器微型化和廉价化，在诸多研究中已经得到应用。在光学系统优化方面，光纤扮演了重要的角色，具有数值孔径大、柔韧性好、可以使光线进行曲线传播等特点，代替复杂的透镜组，使得仪器变得非常简洁、紧凑［2，9－14］。LED 作为一种非相干光源，具有很大的发散角，而通常选用的光纤直径多为几百甚至几十微米，因此提高LED 发散光与光纤的耦合效率是提高检测灵敏度的关键。为了降低柱外效应的影响，检测器的检测池通常在微升或纳升级别，对于小型分析系统来说则需要更小的体积，这就对光纤与检测池的耦合以及装配精度提出了极高的要求，任何环节出现微小的偏差都可能导致检测灵敏度显著下降。

作者报道了一种体积小、功耗低、装配简单的小型LED 诱导荧光检测器，采用正交型光学系统，以LED作为激发光源，研制了高精度加工的光纤－毛细管自校准平台以及光电转换和信号采集模块，基于Lab－VIEW 图形化编程语言开发了上位机程序。以荧光素钠为目标化合物，对检测器性能进行了评价，优化了氨基酸的衍生化方法，并进行了异硫氰酸荧光素（FITC）衍生化氨基酸的分离检测。

1 实验

1.1 试剂与仪器

荧光素钠，分析纯，北京拜尔迪生物公司；硼酸、硼砂，分析纯，北京化学试剂公司；甲醇，色谱纯，Sigma；实验用水为超纯水。

RIGOL L－3000型高效液相色谱仪；LED（LXmL－PR01－0225，中心发射波长465～470nm，5 V，700 mA），钧智科技有限公司；R－003型准直透镜，昴氏（上海）电子贸易有限公司；H5784型光电倍增管，滨松光子学商贸（中国）有限公司；多模光纤（N.A＝0.29，芯径100μm，外径140μm），北京星源奥特光电技术有限公司；滤光片（sp485短通滤光片和lp515长通滤光片），北京京仪博电光学技术有限责任公司；47－221型光纤准直器，爱特蒙特（深圳）光学有限公司。

1.2 正交型LED诱导荧光检测器的研制

1.2.1 光路设计

检测器采用正交型光路设计，如图1所示。

图1 正交型光路结构示意图Fig.1 Structure diagram of orthogonal optical arrangement

LED 的散射光经准直透镜准直成平行光，由光纤准直器耦合进入100μm 芯径的多模光纤，并传导至检测窗口，射入作为检测池的100μm 内径的熔融石英毛细管中。激发的荧光由垂直方向的荧光透镜收集，经过长通滤光片滤去波长小于510nm 的杂散光，最终到达光电倍增管进行光电转换。为避免激发光进入光电倍增管造成背景水平升高，在光纤准直器之前和荧光收集透镜之后分别配置了短通和长通滤光片。

1.2.2 系统实现

(1) 微网运行控制技术 与传统的电力系统控制技术不同,微网侧重并、离网控制技术(分布式电源控制技术有下垂控制技术、v/f控制技术、p/v控制技术)。此外,微网整体运行控制也是微网领域的热点和趋势。

研制的LED 诱导荧光检测器采用模块化设计，主要包括LED 光纤光源、光纤－毛细管自校准平台、信号采集卡和上位机程序。图2为集成的正交型LED 诱导荧光检测器原理样机。

1.2.2.1 LED 光纤光源设计（图3）

光纤光源主要包括：高亮度LED 灯及其配套的准直透镜，二者通过LED 电路板的定位孔安装在一起。连接件中安装有短通滤光片，通过螺纹与外壳装配，并将LED 灯与准直透镜固定在外壳中。准直透镜一端安装在连接件的上端，另一端连接SMA 接口的多模光纤。LED 光纤光源外壳为散热性能良好的铝制材料，LED 电路板采用铝基板，可将LED 灯产生的热量散发到外界环境，保持LED 灯发光功率的稳定。

图2 正交型LED诱导荧光检测原理样机Fig.2 Principle prototype of LED induced fluorescence detector based on orthogonal optical arrangement

图3 LED光纤光源结构示意图Fig.3 Structure diagram of LED fiber light source

1.2.2.2 光纤－毛细管自校准平台设计（图4）

采用高精度机械加工，在平台上形成2条截面为U 型的定位槽（图4a），基准轴2和3所指的定位槽分别放置毛细管（外径375μm）和光纤（外径140μm），深度分别为285μm 和170μm，底部圆形直径分别为375μm 和140μm；基准轴1为垂直方向的荧光收集透镜中心轴。放置于对应定位槽内的光纤和毛细管与U 型槽的圆形底部完全匹配，并且二者的中心轴互相垂直相交于f点（图4b），f点也是荧光收集透镜的焦点，从而实现光纤－毛细管的自校准，同时使荧光检测窗口处于荧光收集透镜的焦点位置，在不使用辅助校准设备的前提下，实现三者中心轴互相垂直相交，达到最佳的荧光激发和收集效率。

1.2.2.3 信号采集卡设计

硬件电路主要包括LED 灯和PMT 供电电源模块、荧光信号采集模块和RS232串口通讯模块，其中荧光信号采集模块最为重要。本设计采用模数转换芯片AD7734将光电倍增管传输的模拟信号转换为数字信号，由微处理器MSP430F449 进行数据处理，通过RSR232串口与上位机进行数据传输。

本设计基于LabVIEW 图形化编程语言编写了用于数据显示和处理的工作站软件，包括两大模块：在线数据采集模块和离线数据分析模块。其中在线数据采集模块可以进行串口配置、数据实时采集与显示、数据保存；离线数据分析模块可以进行历史数据载入、数据处理并生成报表。

图4 光纤－毛细管自校准平台及激发部位结构示意图Fig.4 Self－calibration platform of optical fiber and capillary tube and structure diagram of excitation part

1.3 检测器性能测试

以荧光素钠为目标化合物，通过自动进样器将荧光素钠引入流路，由液相色谱泵驱动进入检测池（由于只需测定检测性能，并未涉及到分离，所以未连接色谱柱）。流动相：20×10－6mol·L－1硼酸盐缓冲溶液（pH 值9.37）；流速：1mL·min－1；进样量：20μL。

1.4 氨基酸分离检测

色谱条件：RIGOL L－3000型高效液相色谱系统，Diamonsil C18反相色谱柱，进样量20μL，流动相为甲醇－硼酸盐缓冲溶液（pH 值9.37）（30∶70，体积比）。

氨基酸衍生化和HPLC 分离检测：在避光条件下，取100μL甘氨酸溶液置于10mL容量瓶中，加入适量的FITC溶液，振荡混匀，用pH 值为9.37 的硼酸盐缓冲溶液定容至10mL，在特定温度下孵育一定时间，待用。

将衍生化的氨基酸进行HPLC 分离检测，在每次实验完成后调整流动相比例为80%甲醇将未洗脱的FITC冲出再进行下一次分析。由于FITC 与氨基酸必须在高浓度下反应才能得到较高的产率，在进行高效液相色谱分析前，需要对样品进行适当稀释，用0.22μm滤膜过滤后再进样分析。

2 结果与讨论

2.1 检测器性能测试结果

2.1.1 溶液pH 值对荧光素钠荧光强度的影响

荧光素钠作为黄绿光区中的一种荧光染料，具有较高的能量转换效率，并且其荧光强度与其溶液的pH 值直接相关，因此在测试荧光检测器性能前有必要对溶液pH 值与荧光素钠荧光转换效率的关系进行考察。采用流动注射模式，在不同pH 值流动相条件下对1×10－7mol·L－1的荧光素钠进行检测，记录其色谱峰面积（n＝5），结果如图5所示。

图5 不同pH 值下荧光素钠的荧光响应Fig.5 Fluorescent response of sodium fluorescence at different pH values

由图5可以看出：在酸性和弱碱性环境中，荧光素钠产生的荧光强度较低；随着pH 值的增大，荧光强度逐渐增强，在pH 值为9.37 时达到最强；但是当pH值增大到10以后，荧光强度呈减弱趋势。

2.1.2 性能测试

配制系列浓度的荧光素钠溶液，采用流动注射模式，在同一实验条件下分别进样5次，进行性能测试，得到最低检测量为1.02ng、最低检测限为6.75×10－8mol·L－1（S／N＝3），检测系统在1.35×10－7～43.2×10－7mol·L－1范围内线性关系良好，线性方程为y＝0.1525x－15.669，R2＝0.9992。

图6为1.35×10－7mol·L－1荧光素钠的HPLC图谱。

图6 1.35×10－7 mol·L－1荧光素钠的HPLC图谱Fig.6 HPLC of 1.35×10－7 mol·L－1 sodium fluorescence

2.2 检测器稳定性测试结果

分别将荧光素钠供试品溶液连续进样5次，记录色谱峰，以峰面积考察检测器稳定性，结果见表1。

表1 LED诱导荧光检测器的稳定性测试结果Tab.1 Stability testing results of LED induced fluorescence detector

由表1可知，RSD 值小于1，表明该检测器稳定性良好。

2.3 氨基酸衍生化条件的选择

2.3.1 FITC与氨基酸物质的量比对衍生化的影响

FITC与氨基酸物质的量比是影响衍生物产率的重要因素之一。本实验选用甘氨酸（Gly）与FITC 反应来考察不同物质的量比对衍生反应的影响，将FITC溶液与甘氨酸溶液分别按物质的量比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、8∶1、10∶1混合，室温下避光反应24h后进行高效液相色谱检测，以FITC－Gly衍生产物峰面积对FITC 与甘氨酸物质的量比作图，结果见图7。

图7 FITC与甘氨酸物质的量比对衍生化的影响Fig.7 Effect of the molar ratio of FITC to Gly on derivatization

由图7可以看出，FITC与甘氨酸物质的量比从1∶1增大到5∶1时，峰面积逐渐增大，继续增大物质的量比，峰面积变化很小。因此，选择最佳的FITC 与氨基酸的物质的量比为5∶1。

2.3.2 反应温度与反应时间对衍生化的影响

化学反应速率除与反应物本身的性质相关外，外界因素（如温度、浓度、催化剂等）也会对其产生影响。

本实验考察了反应温度与反应时间对衍生化反应的影响。按照FITC与甘氨酸物质的量比5∶1配制反应液，采用高效液相色谱法在特定时间测定FITCGly衍生产物的峰面积，以不同温度的峰面积对时间作图，结果见图8。

图8 反应温度和反应时间对衍生化的影响Fig.8 Effects of reaction temperature and reaction time on derivatization

由图8可以看出：0 ℃和20 ℃下的FITC－Gly衍生产物峰面积远小于37 ℃和60 ℃；37 ℃和60 ℃下最终的衍生产物的峰面积相差不大；60 ℃反应4h，衍生产物的峰面积就可以达到最大值，而37℃需要反应24h。考虑到FITC 在较高温度下稳定性较差，副产物增多，选择37 ℃孵育。

2.4 衍生化氨基酸的分离

采用高效液相色谱法分离4种FITC 衍生化的氨基酸，实验分别采用3种流动相甲醇－水（20∶80）、甲醇－磷酸盐缓冲溶液（10×10－6mol·L－1，pH 值为8.0）（30∶70）和甲醇－硼酸盐缓冲溶液（10×10－6mol·L－1，pH 值为9.37）（30∶70）进行等浓度洗脱，分离衍生化氨基酸。结果发现，用甲醇－硼酸盐缓冲溶液作流动相，衍生化的氨基酸与游离FITC 可以得到基线分离，如图9所示。

3 结论

研制了一台基于正交型光路设计的LED 诱导荧光检测器，以LED 代替激光器作为激发光源，在光学系统中引入光纤代替透镜组，使整机的体积和功耗大大降低。采用流动注射模式，以荧光素钠为目标化合物对检测器进行了性能评价。结果表明，该荧光检测器灵敏度和线性范围可以满足常规检测需要，相对于常规激光诱导荧光检测器，具有小型化、成本低、光学结构简单的特点，易于装配和使用。

图9 衍生化氨基酸的分离Fig.9 Separation of derivative amino acids

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