四臂星型生物素化聚乙二醇－聚丙交酯的合成与性能研究

（山东省药学科学院山东省医用高分子材料重点实验室，山东济南250101）

聚丙交酯（PLA）由于其优良的生物降解性、生物相容性及安全性，一直被视为一种具有优越应用前景的医用可降解高分子材料，其作为药物控释载体方面的应用一直是近年来的研究热点［1］。但由于PLA 的疏水性，其在体内与细胞的相容性较差，容易被体内的巨噬细胞吞噬。此外，PLA 作为药物载体也不具有主动靶向性。因而，对其进行亲水性改性和靶向修饰的研究非常多［2－4］。使用改性和修饰的PLA 作为药物载体可以大大提高药物的生物利用度，降低药物的毒副作用。相对于线性PLA，多支化、星型PLA 分子表面有高密度的官能团且内部易形成大量的空腔，使药物分子可以物理包封于聚合物的内部空腔中，从而提高药物的包载率［5］。

生物素－亲和素系统（biotin－avidin system，BAS）是20世纪70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统，具有灵敏度高、特异性强、稳定性高的特点［6－7］。目前，通过BAS介导的肿瘤靶向治疗已成为最新研究热点之一。将药物或药物载体进行生物素化，与含有生物素的抗体通过亲和素的桥连作用而连接，然后通过抗体－抗原间的特异识别作用，便可以实现对靶细胞的定向输送［8－9］。

作者合成了一种四臂星型生物素化聚乙二醇－聚丙交酯嵌段共聚物［PET－（PLA－PEG－biotin）4］，并对其化学结构和性能进行了研究。拟为其作为一种新型的靶向药物载体的研究和应用提供参考。合成路线如图1所示。

图1 四臂星型生物素化聚乙二醇－聚丙交酯的合成路线Fig.1 The synthetic route of 4－arms star polymer PET－（PLA－PEG－biotin）4

1 实验

1.1 试剂

丙交酯（LA，左旋，纯度≥99.5%），参照文献［10］自制；季戊四醇（PET），分析纯，国药集团化学试剂有限公司；辛酸亚锡，分析纯，Sigma 公司；聚乙二醇（PEG，分子量1 500g·mol－1），EHSY 公司；丁二酸酐（SA），分析纯，天津致远化学试剂有限公司；三乙胺（TEA），分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；二环己基碳二亚胺（DCC）、4－二甲氨基吡啶（DMAP）、N－羟基琥珀酰亚胺（NHS）、生物素，纯度≥99%，上海源叶生物科技有限公司；氯仿，色谱纯，美国JT Baker公司；乙醇、二氯甲烷、二甲基亚砜，分析纯，天津广成化学试剂公司。

1.2 四臂星型生物素化聚乙二醇－聚丙交酯的合成

1.2.1 四臂星型聚丙交酯－聚乙二醇嵌段共聚物［PET－（PLA－PEG）4］的合成

PET－PLA4的合成：将一定量的PET 置于反应瓶中，加入0.2%（以单体质量计）的辛酸亚锡，然后加入一定质量的LA，在150 ℃、70 Pa 下磁力搅拌反应24h，产物用二氯甲烷溶解后用乙醇沉淀纯化，50 ℃真空干燥48h。

羧基化PET－PLA4的合成：称取一定量的PETPLA4和丁二酸酐（物质的量比1∶4.5），加入适量三乙胺及4－二甲氨基吡啶，溶于一定量的二甲基亚砜中，室温下反应24h，产物于无水乙醇中沉淀洗涤3次，真空干燥48h。

PET－（PLA－PEG）4的合成：称取一定量的羧基化PET－PLA4和PEG（物质的量比1∶4），加入适量二环己基碳二亚胺和4－二甲氨基吡啶，溶于二氯甲烷中，40 ℃磁力搅拌反应24h，产物于无水乙醇中沉淀，40℃真空干燥48h。

1.2.2 琥珀酰亚胺生物素酯（biotin－NHS）的合成

称取一定量的生物素和N－羟基琥珀酰亚胺（物质的量比1∶1.2），加入二环己基碳二亚胺，以二甲基甲酰胺为溶剂，置于80℃油浴中磁力搅拌至完全溶解后于室温下继续搅拌反应24h。产物于冷的异丙醇中沉淀，抽滤得白色粉末，然后再溶于二甲基甲酰胺中，重结晶2次，产物于40 ℃真空干燥48h。

1.2.3 四臂星型生物素化聚乙二醇－聚丙交酯［PET－（PLA－PEG－biotin）4］的合成

称取一定量的PET－（PLA－PEG）4和biotin－NHS（物质的量比1∶1.2），加适量二甲基亚砜溶解，通氮气保护，40 ℃磁力搅拌反应48h。产物于无水乙醇中沉淀，40 ℃真空干燥48h，得白色粉末状固体。

1.3 表征方法

以CDCl3为溶剂，采用德国Bruker Avance 400 MHz型核磁共振仪测定聚合物的核磁图谱；采用美国Waters 2414型凝胶渗透色谱仪（GPC）测定聚合物的重均分子量、数均分子量及分子量分布系数，氯仿为流动相，聚苯乙烯为标准品，流速1.0mL·min－1，测试温度30℃；采用日本岛津DSC60型示差扫描量热仪测定聚合物的热性能，升温速率10 ℃·min－1；采用瑞士Krüss公司Krüss－K12型程序界面张力仪测定聚合物静态水接触角。

2 结果与讨论

2.1 嵌段共聚物的结构表征

2.1.1 PET－PLA4与PET－（PLA－PEG－biotin）4的核磁共振氢谱（图2）

图2 PET－PLA4（a）与PET－（PLA－PEG－biotin）4（b）的核磁共振氢谱Fig.2 1 HNMR Spectra of PET－PLA4（a）and PET－（PLA－PEG－biotin）4（b）

在PET－PLA4的图谱（图2a）中：5.1～5.2ppm处是PLA 链段上次甲基的质子峰；1.5～1.6ppm 处是PLA 的甲基质子峰；4.2ppm 处的小峰是与丙交酯聚合后的季戊四醇分子上亚甲基的质子峰。

在PET－（PLA－PEG－biotin）4的图谱（图2b）中：PLA 链段上的甲基和次甲基的质子峰位置与PETPLA4一致；3.65ppm 处是PEG 链段上亚甲基的质子峰；而4.2ppm 和4.5ppm 处的小峰分别为生物素分子上与亚胺基相邻的两个次甲基的特征峰。

从PET－PLA4的图谱中可以看出，原季戊四醇的亚甲基在3.45ppm 处的特征峰消失，与丙交酯聚合后其亚甲基峰位移至4.2ppm 处，说明季戊四醇与丙交酯反应完全。通过4.2ppm 处季戊四醇亚甲基质子峰面积与1.5～1.6ppm 处PLA 链段甲基的质子峰面积之比，推算得出所合成的PET－PLA4的数均分子量约为17 000g·mol－1。从PET－（PLA－PEG－biotin）4的图谱中生物素相应的质子峰面积与PEG 和PLA 的质子峰面积的比例，可以推算出生物素的接枝率为4.43%，此接枝率远高于同分子量的线性聚合物。

2.1.2 PET－PLA4与PET－（PLA－PEG－biotin）4的分子量

凝胶渗透色谱测定结果表明，PET－（PLA－PEGbiotin）4的分子量高于PET－PLA4，PET－PLA4的数均分子量为18 498g·mol－1，稍大于核磁推算的理论值17 000g·mol－1，其重均分子量为31 674g· mol－1，PDI 为1.712。而PET－（PLAPEG－biotin）4的为23 872g·mol－1，略小于核磁理论推算值23 896g·mol－1，其为43 957g·mol－1，PDI为1.841，分子量分布较窄。该测量结果与核磁推算结果基本一致，两者数值上的差异主要源于两种测试方法的不同及系统本身的误差。

2.2 嵌段共聚物的热性能分析

PET－PLA4和PET－（PLA－PEG－biotin）4的示差扫描量热曲线如图3所示。

从图3可以看出：PET－PLA4仅在160 ℃左右有一明显的吸热峰，这是聚丙交酯的熔融峰；PET－（PLA－PEG－biotin）4在相同温度下也有一吸热峰，是共聚物中聚丙交酯链段的熔融引起的，除此以外，共聚物在45 ℃左右还有一较小的吸热峰，与PEG 的熔融温度一致，而生物素由于熔融温度高，且相对含量低，在DSC谱图中未有表现。

图3 PET－PLA4 与PET－（PLA－PEG－biotin）4 的示差扫描量热曲线Fig.3 DSC Curves of PET－PLA4and PET－（PLA－PEG－biotin）4

2.3 嵌段共聚物的亲水性分析

PET－PLA4和PET－（PLA－PEG－biotin）4的静态水接触角图片如图4所示。

图4 PET－PLA4 与PET－（PLA－PEG－biotin）4 的静态水接触角图片Fig.4 Static water contact angle images of PET－PLA4and PET－（PLA－PEG－biotin）4

由图4可知，PET－PLA4的静态水接触角明显大于PET－（PLA－PEG－biotin）4。接触角越大，说明其亲水性越差，可知PET－（PLA－PEG－biotin）4的亲水性优于PET－PLA4。在共聚物结构单元中，PLA 链段及生物素分子都是疏水性的，而PEG 为亲水性，说明PEG的引入明显改善了材料表面的亲水性。

3 结论

以季戊四醇为引发剂，合成了四臂星型聚丙交酯，然后与聚乙二醇反应，合成了四臂星型聚丙交酯－聚乙二醇共聚物［PET－（PLA－PEG）4］，最后生物素活化后与共聚物末端羟基反应，合成了四臂星型生物素化聚乙二醇－聚丙交酯［PET－（PLA－PEG－biotin）4］。核磁表征发现，PET－（PLA－PEG－biotin）4四臂星型结构大大提高了生物素的接枝率；凝胶渗透色谱测定表明，其分子量分布较窄；DSC 测试表明，其热性能和PETPLA4不同；静态水接触角测试表明其亲水性有明显改善。

［1］LI S，VERT M.The Encyclopedia of Controlled Drug Delivery［M］.New York：Wiley，1999：71－93.

［2］NOBS L，BUCHEGGER F，GURNY R，et al.Biodegradable nanoparticles for direct or two－step tumor immunotargeting［J］.Bioconjugate Chemistry，2006，17（1）：139－145.

［3］XU J S，HUANG J，QIN R，et al.Synthesizing and binding dualmode poly（lactic－co－glycolic acid）（PLGA）nanobubbles for cancer targeting and imaging［J］.Biomaterials，2010，31（7）：1716－1722.

［4］REN W H，CHANG J，YAN C H，et al.Development of transferrin functionalized poly（ethylene glycol）／poly（lactic acid）amphiphilic block copolymeric micelles as a potential delivery system targeting brain glioma［J］.Journal of Materials Science－Materials in Medicine，2010，21（9）：2673－2681.

［5］PAN J，VENKATRAMAN S S，FENG M，et al.Micelle－like nanoparticles of star－branched PEO－PLA copolymers as chemotherapeutic carrier［J］.Journal of Controlled Release，2005，110（1）：20－33.

［6］EDWARD A B，MEIR W.The use of the avidin－biotin complex as a tool in molecular biology［J］.Methods of Biochemical Analysis，1980，26：1－45.

［7］EDWARD A B，MEIR W.The avidin－biotin complex in immunology［J］.Immunology Today，1984，5（2）：39－43.

［8］JESSICA R N，SAID D F，THOMAS P Q，et al.Bifunctional phage－based pretargeted imaging of human prostate carcinoma［J］.Nuclear Medicine and Biology，2009，36（7）：789－800.

［9］PAGANELLI G，GRANA C，CHINOL M，et al.Antibody－guided three－step therapy for high grade glioma with yttrium－90biotin［J］.European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging，1999，26（4）：348－357.

［10］GILDING D K，REED A M.Biodegradable polymers for use in surgery－polyglycolic／poly（actic acid）homo－and copolymers：1［J］.Polymer，1979，20（12）：1459－1464.