大港油田产出水中微生物对正构烷烃的降解

（北京科技大学土木与环境工程学院，北京100083）

随着社会经济的发展，世界各国对石油的需求量日益增大。然而，石油在给人类社会发展带来巨大推动作用的同时，也增加了对环境的污染。据报道，当前世界石油年产量约22 亿t，但有800 万t进入环境。我国石油年产量已超过1 亿t，每年新污染土壤10万t［1］。石油中含量最高的成分是各种链长的烷烃，特别是C8～C40的正构烷烃［2］。自20世纪80年代以来，生物修复以其无污染、费用低、效果好逐渐成为石油污染土壤修复的重要手段［3］。自然界中存在的能够降解烷烃的微生物约有100余属、200多种，分属于细菌、放线菌、霉菌、酵母等［4］。目前，筛选能够高效降解烷烃的微生物是研究的热点［5－7］。但单菌只能降解特定类型的烷烃，难以对石油中所有烷烃达到很好的降解效果。油田产出水中存在大量能够降解烷烃的微生物，通过对菌群进行活化可以提高烷烃的降解效果。

生物体内的各种代谢过程都伴随着能量的转移和热变化。采用一般的检测手段很难获得满意的结果，而微量量热仪具有较高灵敏度（0.1μW）［8－9］，可连续检测生物代谢过程所产生的热量，对微生物的代谢活性进行实时、在线、原位的监测。

作者在此分别以十二烷、十六烷、原油为唯一碳源，测定大港油田3口油井产出水中微生物对正构烷烃的降解率，同时对产出水中微生物的代谢热进行测定，进而分析代谢热和降解率之间的相关性。

1 实验

1.1 材料、试剂、培养基与仪器

油田产出水分别采自天津大港油田孔店区块1032－4、1032－1、1050－2油井；原油取自大港油田三次采油工艺研究所。

正十二烷、正十六烷，分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

LB液体培养基；葡萄糖培养基；无机盐培养基（g·L－1）：（NH4）2SO43，KH2PO40.5，Na2HPO4·12H2O 1.26，MgSO4·7H2O 0.54，微量元素液1 mL，pH 值7.0。

TOC－V 型总有机碳分析仪；AA－6300C型火焰原子吸收仪；QP2010型GC－MS分析仪，日本岛津公司；TAM（Ⅲ）型微量量热仪，美国TA 仪器公司；PHS－3C型pH 计，上海雷磁公司。

1.2 产出水的理化性质测定

分别取3口油井的产出水150mL，过0.22μm 滤膜，取滤液进行理化性质测定。产出水的pH 值用pH计测定；产出水中Na＋、Ca2＋、Mg2＋的含量用原子吸收仪测定；总有机碳（TOC）和总氮（TN）的含量用总有机碳分析仪测定；总磷（TP）的含量用钼酸铵法测定。

1.3 产出水中微生物的代谢热测定

采用微量量热法测定：设定微量量热仪温度为28 ℃。在无菌操作条件下向安瓿瓶中加入2 mL LB液体培养基和10μL产出水，密封，放入微量量热仪中测定代谢热，以时间为横坐标、产热功率为纵坐标绘制新陈代谢曲线。

在微生物的指数生长期，产热功率Pt与生长速率常数k之间有公式：

式中：P0、Pt分别为指数生长期初始和t时刻的产热功率。根据式（1）进行线性拟合，即可得到生长速率常数k，该常数是反映微生物繁殖速度的重要指标。

1.4 产出水中微生物对正构烷烃的降解实验

分别以十二烷、十六烷、原油为碳源，对3口油井产出水中微生物降解烷烃的能力进行研究。原油添加量为0.1%（质量浓度），十二烷、十六烷添加量为0.2%（体积分数）。依次添加1%的葡萄糖培养基对产出水进行活化，待OD600值为0.5左右时进行接种，接种量为2%，然后密封瓶塞减少烷烃的挥发。以不加菌液作为空白对照组，培养振荡条件为30 ℃、160r·min－1。

1.5 降解率测定

分别测定烷烃在第5d、第10d的降解率和原油在第10d的降解率。取10mL 正己烷与50mL菌液充分混合，静置10min后分别收集上层有机相和下层水相。重复此操作2次，合并有机相，弃下层水相。将有机相过无水硫酸钠柱除去水分，蒸发浓缩至2mL，进行GC－MS分析，按式（2）计算降解率（ω）：

式中：c0为空白烷烃的质量浓度，通过内标与正构烷烃的峰面积比值计算；c1为培养液中残留的烷烃质量浓度。

GC－MS条件：进样口无分流模式，温度300 ℃；Rtx－5MS型弹性石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；载气（氦气）流速为1.2 mL·min－1；炉温60 ℃保持1min，以15 ℃·min－1升到150 ℃，再以6 ℃·min－1升到320 ℃保持10min。

2 结果与讨论

2.1 产出水的理化性质（表1）

从表1可以看出：3口油井产出水为中性或微偏碱性，pH 值差异不大；3口油井产出水中的总有机碳含量相近；1032－4井产出水中的总氮含量最高，达到8.54mg·L－1；1050－2井产出水中的总磷含量最低，仅为0.33mg·L－1；由于油藏为高矿化环境，对应的金属离子含量普遍较高，其中Na＋的含量最高，均在1 000mg·L－1左右。

表1 产出水的理化性质／（mg·L－1）Tab.1 The physical and chemical properties of produced water／（mg·L－1）

2.2 产出水的能量代谢

用微量量热仪测得的产出水中微生物的新陈代谢曲线如图1所示，部分微量热参数见表2。

图1 产出水中微生物的新陈代谢曲线Fig.1 The metabolism curves of microorganism in different produced water

表2 产出水的微量热参数Tab .2 The microcalorimetric parameters of produced water

由图1和表2可看出：1032－4井产出水总产热量、最大产热功率均最低，在125h之前微生物几乎没有生长，125h之后开始迅速生长，在138h达到最大产热功率（图1c）；1050－2井产出水总产热量较高，培养18h后达到最大产热功率429.40μW，微生物代谢活跃，之后随着氧气和营养物质的耗竭，菌体逐渐死亡（图1a）；1032－1井产出水总产热量最高，但是生长速率常数较小，在测量期间生长较平缓，生长周期长（图1b）。由此可知，3口油井产出水中的微生物在能量代谢方面存在较大差异，说明产出水中的微生物数量及种类存在差异。

另外，1050－2井产出水中微生物的生长速率常数最大，1032－4井次之，1032－1井最小（表2）。1050－2井微生物的出峰时间最早，1032－4井的出峰时间相对较晚（图1），可能是由于代谢过程后期厌氧微生物被激活，整体活性升高。

2.3 正构烷烃的降解实验

2.3.1 正构烷烃的降解效果

分别以十二烷、十六烷为碳源，考察3口油井产出水中的微生物对其降解效果，烷烃在第5d、第10d的降解率见图2。

图2 正构烷烃在第5d、第10d的降解率Fig.2 The degradation rate of n－alkanes after incubation for 5dor 10d

由图2可看出：3口油井产出水中的微生物均能较好地降解烷烃；其中，1050－2 井产出水在以十六烷为唯一碳源的培养基中经过短暂的适应期，菌群迅速生长，培养液很快呈现浑浊，经过5d的培养，十六烷降解率达到80%，第10d降解率高达96.65%，且对十二烷的降解效果更好，10d的降解率达到98.67%；1032－4井产出水中的微生物对十六烷、十二烷的降解能力相对最小，10d的降解率均为85%左右。

2.3.2 原油的降解效果

以原油为碳源，考察3口油井产出水的微生物对其降解效果，降解产物（m／z＝85）的离子色谱见图3。

图3 降解产物（m／z＝85）的离子色谱Fig.3 Ion chromatograms of the degradation products（m／z＝85）

选取不易被生物降解的藿烷（m／z＝191）作为生物标志物对原油中烷烃在第10d的降解情况进行分析［10］，结果见图4。

图4 原油中正构烷烃在第10d的降解率Fig.4 The degradation rate of n－alkanes in crude oil after incubation for 10d

由图4可看出：3口油井产出水中微生物对原油的平均降解率分别为74.35%、77.45%、81.07%；不仅对短链烷烃具有很好的降解效果，对C20以上的烷烃依然具有60%以上的降解率；3口油井产出水中微生物为混合菌群，拥有能够降解各种链长烷烃的优势菌株，因此其对烷烃的利用不局限于专一链长的烷烃；而单菌只能利用特定的底物，不能实现对其它烷烃的降解。与之前降解指定烷烃（十二烷和十六烷）的结果相似，1050－2井产出水中微生物对原油中烷烃的降解能力最强，1032－4井的最弱。

2.4 相关性分析

为研究3口油井产出水中微生物对正构烷烃降解率的影响，分析了各因素之间的相关性，如表3所示。

表3 各因素之间的相关性分析Tab.3 The correlation analysis among different parameters

由表3可知：（1）产出水能量代谢与降解率之间存在显著的正相关，代谢活跃的微生物对烷烃的降解率最大，特别是最大产热功率，相关性系数均达到0.96以上，表明代谢活性高的样品更能有效地利用烷烃［11］；（2）TOC、TN、TP的含量与降解率呈负相关，表明产出水中高有机质含量抑制了微生物的活性；（3）Na＋、Ca2＋、Mg2＋的浓度与降解率均呈正相关，表明当前离子浓度没有对产出水中微生物产生明显的抑制作用，说明现有的油藏条件适合培养高效的烷烃降解菌株，有利于现场的微生物修复技术的开展。

3 结论

对大港油田3口油井产出水中的微生物进行能量代谢研究，结果表明，1050－2井产出水中微生物的产热功率最高，为429.40μW，生长速率常数最大，为0.49h－1。1050－2井产出水中微生物对十二烷、十六烷的10d降解率分别达到98.67%、96.65%，对原油中烷烃的降解效果也高于其它产出水，其中对C12～C35的正构烷烃降解率可达81.07%。相关性分析证实了代谢活性高的微生物能有效降解烷烃，同时也发现高有机质的环境不利于降解烷烃的微生物的生存。

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