结核感染T细胞检测在骨关节结核中的诊断价值

贾晨光，姚黎明*，李秀武，刘丰胜，章志华，张金文

(1.河北省胸科医院骨科，河北石家庄050041;2.河北省胸科医院病理科，河北石家庄050041; 3.河北省胸科医院科教处，河北石家庄050041)

结核感染T细胞检测在骨关节结核中的诊断价值

贾晨光1，姚黎明1*，李秀武2，刘丰胜1，章志华3，张金文3

(1.河北省胸科医院骨科，河北石家庄050041;2.河北省胸科医院病理科，河北石家庄050041; 3.河北省胸科医院科教处，河北石家庄050041)

目的评价结核感染T细胞检测(tuberculous infection of T cells spot test，T-SPOT.TB)在疑似骨关节结核病中的诊断价值。方法 选取80例确诊为骨关节结核患者和44例排除结核患者。分别进行抗酸染色、结核菌培养、实时荧光定量PCR检测及T-SPOT.TB，比较并分析检测结果。结果T-SPOT.TB的敏感度、特异度和准确度分别为82.5%、75.0%、79.8%。T-SPOT.TB的阳性检出率显著高于抗酸染色、结核分枝杆菌培养(P＜0.05)，而在不同疾病部位(脊柱、四肢关节)及不同病程分组间阳性检出率差异无统计学意义(P＞0.05)。结论T-SPOT.TB可以作为骨关节结核病的重要辅助诊断方法。

结核，骨关节;结核感染T细胞检测;诊断

目前结核病仍是严重危及人类健康的主要传染病之一。据世界卫生组织报道，全球每年新发结核病患者约890万。据第5次全国结核病流行病学调查显示，我国已有1/3以上的人口感染了结核菌，15岁及以上人群活动性肺结核的患病率为459/10万，涂阳肺结核患病率为66/10万［1］。骨关节结核病占结核患者总数的1%～5%。控制结核病的关键问题是快速诊断并及时治疗。结核病的实验室诊断是发现传染源的主要途径和手段，也是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据［2］。目前结核感染T细胞检测(tuberculous infection of T cells spot test，TSPOT.TB)已经列入欧美等发达国家的结核病诊疗指南，以协助诊断结核感染的存在［3］。该检测是利用结核菌感染者外周血单核细胞中存在结核特异的效应T淋巴细胞，这些淋巴细胞在受到结核杆菌特异抗原刺激后分泌γ干扰素而设计的T细胞免疫斑点试验，具有较高的灵敏度和特异度。本研究旨在探讨T-SPOT.TB在诊断骨关节结核病中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年5月—2014年5月河北省胸科医院骨科收治的怀疑骨关节结核的患者124例，男性66例，女性58例，年龄14～83岁，平均(47.9±23.5)岁。根据病史、临床特点、影像学表现、组织病理学和病原学检查结果以及抗结核治疗效果进行诊断，分为确诊骨关节结核患者80例，排除结核患者44例。见表1。

表1 124例怀疑骨关节结核患者临床资料Table 1 Clinical characteristics of 124 patients with suspected osteoarticular tuberculosis (例数，%)

1.2 方法 所有患者进行T-SPOT.TB，与临床诊断结果进行比较。另外，对确诊骨关节结核患者组分别进行涂片抗酸染色、结核菌培养、实时荧光定量PCR检测结核分枝杆菌，比较阳性检出率。根据病变部位(脊柱/四肢关节)及病程(即住院前出现症状的时间:≤6个月，＞6～12个月，＞12～24个月，＞24～48个月)分别评估T-SPOT.TB阳性检出率。

1.2.1 T-SPOT.TB 受试者用肝素锂抗凝采血管抽取5 mL静脉血，即刻轻柔颠倒混匀3～5次，使抗凝剂充分溶解。3 h内将采集的全血分装到3种不同的培养管中，“T”为添加结核特异性抗原ESAT-6、CFP-10的测试培养管，“N”为本底对照培养管，“P”为添加非特异刺激原植物血凝素的阳性对照培养管，每种培养管分装1 mL，分装前需要颠倒混匀3次以上，分装后轻柔颠倒培养管5次并立刻置于37℃培养箱中，静置培养(22±2)h后取出，离心收集上清液，然后用双抗体夹心法定量检测上清中γ干扰素的含量，最后计算刺激培养系统中特异性升高的γ干扰素量判定是否为结核杆菌感染阳性。

1.2.2 涂片抗酸染色 所有诊断为骨关节结核病患者的标本处理均依据“中国防痨协会指导方针”进行［4］。固体组织研碎后采用4%NaOH处理10 min，其他液体标本直接采用4%NaOH处理10 min。6 000 r/min离心15 min，弃上清，用少量生理盐水混匀沉淀物，均匀涂抹于载玻片上，自然干燥后，行抗酸染色镜检。

1.2.3 结核菌培养 余下的悬浮液置于培养基上进行结核菌培养。置于37℃恒温培养箱培养，接种后3、7 d观察，此后每周观察1次，有菌落生长后用抗酸染色验证，若同时为阳性记录为阳性，否则为阴性，至第8周仍无细菌生长记录为阴性。

1.2.4 实时荧光定量PCR检测 活组织检查或手术标本采用荧光定量试剂盒检测结核分枝杆菌DNA，具体操作按试剂盒说明书进行。标本经去污和离心后，得到50μL DNA提取液，混匀后沸水煮10 min，4℃放置6～8 h。10 000 r/min离心5 min，取上清用于实时荧光定量PCR检测。

1.3 统计学方法 应用SSPS14.0统计软件进行数据分析，计数资料以百分率表示，分别采用χ2检验和四格表的诊断性试验分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 T-SPOT.TB的敏感度、特异度和准确度 TSPOT.TB的敏感度为82.5%，特异度为75.0%，准确度为79.8%，阳性预测值为85.7%，阴性预测值为70.2%。见表2。

表2 T-SPOT.TB的敏感度、特异度和准确度Table 2 Diagnostic performance of T-SPOT.TB assay in 124 osteoarticular tuberculosis patients (n=124，例数，%)

2.2 不同疾病部位和病程T-SPOT.TB阳性检出率比较 80例骨关节结核患者中包括脊柱结核55例和关节结核25例;病程≤6个月30例，＞6～12个月25例，＞12～24个月15例，＞24～48个月10例。不同疾病部位和病程T-SPOT.TB阳性检出率差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表3。

表3 不同疾病部位和病程T-SPOT.TB阳性检出率比较Table 3 The positive rate of T-SPOT.TB for different locations and courses of osteoarticular tuberculosis (例数，%)

2.3 不同检测方法阳性检出率比较 T-SPOT.TB的阳性检出率显著高于涂片抗酸染色、结核分枝杆菌培养，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表4。

表4 不同检测方法阳性检出率比较Table 4 The positive rates of four test methods in osteoarticular tuberculosis (例数，%)

3 讨 论

骨关节结核病是临床常见且难以进行病原学诊断的疾病。主要原因之一就是骨关节结核病早期病程隐匿，典型的临床症状不明显，易被患者和医生所忽视，且结核分枝杆菌培养时间长，敏感性低，以致临床上经常误诊和漏诊，因此诊断早期骨关节结核及非典型症状疑似结核感染尤为困难。以往诊断骨关节结核病一般根据典型的临床症状、影像学表现、活组织检查或手术标本病理检查以及结核菌培养等综合方法。传统方式仍有各自的缺点和不足:结核分枝杆菌涂片抗酸染色的敏感性很低，本研究中抗酸染色阳性检出率仅为11.2%;结核菌培养耗时较长(需6～8周)，本研究中其阳性检出率为40.0%，容易延误病情的诊治;近年来，实时荧光定量PCR检测技术在诊断骨关节结核病领域中应用愈加广泛，但PCR技术的阳性检出率在不同研究中差异较大［5］，究其原因可能有活组织检查或手术取材部位菌群分布不均，宿主蛋白质、血液及真核细胞DNA环境变异等因素。此外，以上组织标本均通过外科活组织检查或手术途径获得，患者均需承受有创性操作带来的痛苦与风险。

T-SPOT.TB作为一种新的酶免疫检测方法［6］，它的敏感度、特异度高，创伤小(仅需静脉采血5 mL)，操作简单，需要的时间少(2 d就能出检测结果)。近年来，已逐渐被各大医院及检验单位所接受。该检测方法及其相关试剂盒已被美国FDA批准用于临床诊断结核分枝杆菌感染及结核病［7］。其应用的原理是，机体感染结核分枝杆菌后，体内会产生特异性的效应T淋巴细胞，其在体外再次受到结核菌特异性抗原的刺激时，会释放γ干扰素，通过检测γ干扰素的水平或计数分泌γ干扰素的数量，判断机体是否感染结核分枝杆菌，辅助诊断结核病［8］。由于选择的特异性抗原只存在于结核杆菌，且是在卡介苗和大多数非结核杆菌中普遍缺失的RD1区基因片段所表达的蛋白［9］，因此T-SPOT.TB检测的特异性会明显高于结核菌素试验。

本研究结果显示，T-SPOT.TB在诊断骨关节结核病的敏感度为82.5%，接近于先前研究报道诊断肺外结核病的84.0%［10］。其阳性检出率远高于抗酸染色(11.2%)、结核菌培养(40.0%)，略高于实时荧光定量PCR检测(71.2%)。可见T-SPOT.TB对骨关节结核病的检出效能明显优于抗酸染色及结核菌培养，与实时荧光定量PCR检测阳性率大体相同。考虑到以上传统检测方式均需借助侵入性有创操作获得，故T-SPOT.TB有其不可比拟的优势。在不同感染部位方面，T-SPOT.TB诊断脊柱结核的阳性检出率为83.64%，略高于四肢关节结核的80.00%，差异无统计学意义。提示在不同病变部位导致的机体免疫应答基本相同，可广泛应用于脊柱、四肢关节骨结核病的辅助诊断，具有良好的一致性。此外，依病程分组比较，T-SPOT.TB在不同组别中的阳性检出率差异无统计学意义。提示T-SPOT.TB阳性检出率与病程长短无明显相关性，可作为诊断早期骨关节结核病的重要辅助参考指标。

综上所述，T-SPOT.TB可以作为诊断骨关节结核病的重要辅助方法，可尝试应用于诊断筛选早期与不典型症状的疑似骨关节结核病领域。

［1］全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组，全国第五次结核病流行病学抽样调查办公室.2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告［J］.中国防痨杂志，2012，34(8): 485-508.

［2］吴多池，黄守凤，郭爱珍.γ-干扰素释放试验诊断结核分枝杆菌感染的临床意义［J］.广东医学，2011，32(10):1317-1319.

［3］Mazurek GH，Jereb J，Vernon A，et al.Updated guidelines for using interferon gamma release assays to detect Mycobacterium tuberculosis infection-United States，2010［J］.MMWR Recomm Rep，2010，59(RR-5):1-25.

［4］唐神结，高文.临床结核病学［M］.北京:人民卫生出版社，2011:16-17.

［5］Mehta PK，Raj A，Singh N，et al.Diagnosis of extrapulmonary tuberculosisby PCR［J］.FEMS Immunol Med Microbiol，2012，66(1):20-36.

［6］Sun L，Yan HM，Hu YH，et al.IFN-γrelease assay:a diagnostic assistance tool of tuberculin skin test in pediatric tuberculosis in China［J］.Chin Med J(Engl)，2010，123(20):2786-2791.

［7］Mazurek GH，Jereb J，Lobue P，et al.Guidelines for using the QuantiFERON-TB gold test for detecting Mycobacterium tuberculosis infection United States［J］.MMWR Recomm Rep，2005，54(RR-15):49-55.

［8］Lee SW，Lee CT，Yim JJ.Serial interferon-gamma release assays during treatment of active tuberculosis in young adults［J］.BMC Infect Dis，2010，10:300.

［9］Ahmad S.New approaches in the diagnosis and treatment of latent tuberculosis infection［J］.Respir Res，2010，11:169.

［10］贾晨光，李秀武，姚黎明，等.干扰素γ释放试验诊断肺外结核的应用价值［J］.河北医科大学学报，2014，35(10):1129-1131.

(本文编辑:赵丽洁)

Application value of tuberculous infection of T cells spot test in diagnosing osteoarticular tuberculosis

JIA Chen-guang1，YAO Li-ming1*，LI Xiu-wu2，LIU Feng-sheng1，ZHANG Zhi-hua3，ZHANG Jin-wen3
( 1． Department of Orthopedics，Chest Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050041，China; 2． Department of Pathology，Chest Hospital of Hebei Province，Shijiazhuang 050041，China; 3． Department of Education Information，Chest Hospital of Hebei Province， Shijiazhuang 050041，China)

Objective To investigate the value of tuberculous infection of T cells spot test(TSPOT.TB)in the diagnosis of osteoarticular tuberculosis.MethodsThe study enrolled 80 patients who were confirmed osteoarticular tuberculosis and 44 did not have active tuberculosis.Acid-fast staining，mycobacterial culture，real-time quantitative PCR were respectively performed for the patients.The results were compared and analyzed.ResultsThe sensitivity，specificity，accuracy for osteoarticular tuberculosis diagnosis by T-SPOT.TB assay were 82.5%，75.0%and 79.8%.The positive rate of T-SPOT.TB was significantly higher than that of acid-fast staining，mycobacterial culture(P＜0.05).But，there were no statistical difference in different locations(spine or extremities joint)and courses between groups.ConclusionThe results suggested that T-SPOT.TB assay could provide useful aids in the diagnosis of osteoarticular tuberculosis.

tuberculosis，osteoarticular;tuberculous infection of T cells spot test;diagnosis

R529.2

A

1007-3205(2015)02-0148-04

2014-12-19;

2015-01-08

河北省科学技术研究与发展计划项目(12277754)

贾晨光(1975-)，女，河北唐县人，河北省胸科医院副主任技师，医学硕士，从事骨科疾病诊治研究。

*通讯作者。E-mail:yaolm24@126.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2015.02.010