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不同剂量瑞舒伐他汀对实验性动脉粥样硬化大鼠过氧化及血管平滑肌增生的影响

2015-12-28刘爱宁杨文刚鞠树红聂丹凤

河北医科大学学报 2015年2期
关键词:蛋氨酸过氧化瑞舒伐

刘爱宁,杨文刚,鞠树红,聂丹凤,周 晖

(1.上海市普陀区利群医院神经内科,上海200333;2.第二军医大学附属长征医院神经内科,上海200003)

不同剂量瑞舒伐他汀对实验性动脉粥样硬化大鼠过氧化及血管平滑肌增生的影响

刘爱宁1,杨文刚1,鞠树红1,聂丹凤1,周 晖2*

(1.上海市普陀区利群医院神经内科,上海200333;2.第二军医大学附属长征医院神经内科,上海200003)

目的观察不同剂量瑞舒伐他汀对动脉粥样硬化大鼠过氧化及血管平滑肌增生的影响。方法 将46只大鼠随机分为5组。对照组(n=6)给予普通饲料喂养;高蛋氨酸组(n=10)在此基础上加质量分数2%的蛋氨酸;叶酸组(n=10)在高蛋氨酸饲料喂养4周后,叶酸按每天0.8 mg/kg剂量灌胃;瑞舒伐他汀低剂量组(n=10)和高剂量组(n=10)以高蛋氨酸饲料喂养4周后,瑞舒伐他汀分别按每天1、2 mg/kg剂量灌胃。末次灌胃后4 h处死动物取血及颈主动脉。检测各组大鼠血浆同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)、血浆丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)活性及炎症因子表达,测量颈动脉内膜中膜厚度。结果建模后12周,各组血浆Hcy水平均较建模前显著升高,依次为高蛋氨酸组>叶酸组>低剂量组>高剂量组>对照组(P<0.05);瑞舒伐他汀组各过氧化、炎症指标均显著优于高蛋氨酸组,高剂量组MDA、肿瘤坏死因子α、白细胞介素8及基质金属蛋白酶9含量较低剂量组降低,GSH-PX活性则明显增强(P<0.05);高蛋氨酸组、叶酸组与低剂量组颈动脉内膜中膜厚度明显高于对照组、高剂量组(P<0.05)。结论高剂量瑞舒伐他汀对高Hcy性动脉粥样硬化的疗效更佳,可达到更好的过氧化抑制作用,降低动脉血管平滑肌厚度。

动脉硬化;瑞舒伐他汀;肌,平滑

动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种复杂的慢性炎症性疾病,高同型半胱氨酸(hyperhomocysteinemia,HHcy)是近年新确认的AS性心脑血管疾病的独立危险因素,但其导致AS的机制仍未十分清楚[1-2]。瑞舒伐他汀是目前临床上治疗及预防AS的一线用药,具有抗炎、改善内皮功能、稳定斑块等作用,能减轻AS患者的病情和临床结局[3],但关于瑞舒伐他汀对AS的剂量选择及量效关系一直是争议的焦点。本研究通过蛋氨酸饲养大鼠制备实验性AS动物模型,分析瑞舒伐他汀对同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)致AS的疗效,以及其浓度水平与过氧化反应及血管平滑肌增生的关系,旨在为AS预防和治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与主要试剂 健康8周龄的SD雄性大鼠46只,体质量200~250 g,平均(228.1± 12.3)g,由长征医院实验动物中心提供。蛋氨酸购于上海生工生物工程有限公司,瑞舒伐他汀钙片(Rosuvastatin Calcium,商品名:可定)由英国阿斯利康公司提供。

1.2 实验分组与动物模型的建立 将46只大鼠随机分为对照组、叶酸组、高蛋氨酸组、瑞舒伐他汀低剂量组和高剂量组。其中对照组(n=6)给予普通饲料喂养;高蛋氨酸组(n=10)在普通饲料喂养的基础上加质量分数2%的蛋氨酸;叶酸组(n=10)在高蛋氨酸饲料喂养4周后,叶酸按每天0.8 mg/kg剂量灌胃,同时持续高蛋氨酸饮食;低剂量组(n=10)以高蛋氨酸饲料喂养4周后,瑞舒伐他汀按每天1 mg/kg剂量灌胃,同时持续高蛋氨酸饮食;高剂量组(n=10)以高蛋氨酸饲料喂养4周后,瑞舒伐他汀按每天2 mg/kg剂量灌胃,同时持续高蛋氨酸饮食。实验动物操作过程遵照医院动物伦理委员会规程进行。

1.3 检测指标

1.3.1 Hcy及过氧化、炎症指标测定 在末次灌胃后4 h处死大鼠取血,采血后置于含2%乙二胺四乙酸二钠100μL试管中,3 000 r/min离心10 min后分离血清置于-70℃冰箱保存待检。采用高效液相色谱法测定血浆Hcy浓度,采用比色法测定丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX),采用酶联免疫吸附测定法测定肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor -α,TNF-α)、白细胞介素8(interleukin 8,IL-8),采用免疫组织化学染色测定基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases9,MMP-9),均严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.2 颈动脉内膜中膜厚度测定 快速切开颈部,取出左颈总动脉约2 cm,冰冻切片,HE染色处理,采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测定内膜中膜厚度,不同部位测5次取平均值。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行统计学分析,计量资料以±s表示,采用单因素方差分析及q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组建模前后血浆Hcy水平变化 建模前,各组血浆Hcy水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);建模后12周,各组血浆Hcy水平均较建模前显著升高,依次为高蛋氨酸组>叶酸组>低剂量组>高剂量组>对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组建模前后血浆Hcy水平变化Table 1 Plasm a H cy change before and after modeling among different groups (±s,μmol/L)

表1 各组建模前后血浆Hcy水平变化Table 1 Plasm a H cy change before and after modeling among different groups (±s,μmol/L)

*P<0.05与对照组比较 #P<0.05与高蛋氨酸组比较 △P<0.05与叶酸组比较 ☆P<0.05与低剂量组比较(q检验)

Hcy建模前 建模后对照组组别 n6 6.75±1.13 7.22±1.27高蛋氨酸组 10 6.84±1.05 107.95±21.35*叶酸组 10 6.58±1.09 97.25±35.35*#低剂量组 10 6.68±1.03 85.11±31.64*#△高剂量组 10 6.12±1.02 73.72±24.73*#△☆F>0.05 <0.05 0.680 14.830P

2.2 各组血浆过氧化、炎症指标比较 与对照组比较,高蛋氨酸组、叶酸组、低剂量组MDA及炎症指标明显升高,GSH-PX明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05),而高剂量组与对照组之间MDA差异无统计学意义(P>0.05)。低剂量组和高剂量组各过氧化、炎症指标均显著优于较高蛋氨酸组及叶酸组,差异均有统计学意义(P<0.05),且高剂量组MDA、TNF-α、IL-8及MMP-9含量较低剂量组降低,GSH-PX活性则明显增强,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组血浆过氧化、炎症指标比较Table 2 Comparison of plasma peroxide and inflammatory indicators among different groups (±s)

表2 各组血浆过氧化、炎症指标比较Table 2 Comparison of plasma peroxide and inflammatory indicators among different groups (±s)

*P<0.05与对照组比较#P<0.05与高蛋氨酸组比较△P<0.05与叶酸组比较☆P<0.05与低剂量组比较(q检验)

组别 n MDA(μmol/L) GSH-PX(μmol/L) TNF-α(ng/L) IL-8(ng/L) MMP-9(ng/L)对照组 6 5.71±0.83 82.41±11.17 101.50±24.12 45.71±4.63 160.37±15.31高蛋氨酸组 10 13.51±1.72* 45.39±7.44* 457.80±176.01* 91.40±15.31* 310.15±25.70*叶酸组 10 12.48±1.28* 50.72±8.21*# 308.50±145.81*# 84.75±10.87*# 279.21±21.82*#低剂量组 10 9.16±1.17*#△ 62.17±10.76*#△ 277.90±110.46*#△ 76.13±9.24*#△ 221.23±19.46*#△高剂量组 10 6.19±0.96#△☆ 71.59±12.42#△☆ 178.70±75.56*#△☆ 63.51±6.32*#△☆ 191.15±18.37*#△☆F<0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 5.621 9.032 12.910 5.983 13.864P

2.3 各组颈动脉内膜中膜厚度比较 高蛋氨酸组、叶酸组、低剂量组颈动脉内膜中膜厚度明显高于对照组、高剂量组,差异均有统计学意义(P<0.05),而高蛋氨酸组、叶酸组与低剂量组之间两两比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组颈动脉内膜中膜厚度比较Table 3 Comparison of carotid intimal thickness among different groups (±s,mm)

表3 各组颈动脉内膜中膜厚度比较Table 3 Comparison of carotid intimal thickness among different groups (±s,mm)

*P<0.05与对照组比较 #P<0.05与高蛋氨酸组比较 △P<0.05与叶酸组比较 ☆P<0.05与低剂量组比较(q检验)

颈动脉内膜中膜厚度对照组组别 n7.35±0.67高蛋氨酸组 10 10.74±1.05*叶酸组 10 9.21±1.31*低剂量组 10 9.62±1.74*高剂量组 10 7.86±1.08#△☆F6<0.05 5.160P

3 讨 论

AS的发病机制极为复杂,涉及炎症、氧化应激、血管平滑肌异常增生、免疫因素等诸多因素,其中血管内皮细胞的炎性损伤和过氧化与血管平滑肌细胞增殖的关系尤为密切[4-5]。HHcy已被确立为AS的独立危险因素,但如何使用药物干预逆转HHcy性AS尚不清楚。据研究统计,约40%的心脑血管病患者血浆Hcy浓度不同程度的升高,且每升高5μmol/L,心脑血管病的死亡风险增加30%~40%[6]。临床上对HHcy性AS的防治多采用叶酸及维生素进行非特异性治疗,疗效尚无法确定。

瑞舒伐他汀作为迄今为止最强的降脂药物,现已广泛应用于治疗致AS的血脂紊乱,同时还具有稳定斑块、抗炎、抗氧化等非调脂作用[7]。但对于瑞舒伐他汀能否抑制颈动脉新生内膜增生以及其治疗的最适剂量仍存在争议。本研究给予雄性SD大鼠蛋氨酸灌胃的方式构建HHcy性AS大鼠模型,结果显示,建模后12周,各组血浆Hcy水平均较建模前显著升高,依次为高蛋氨酸组>叶酸组>低剂量组>高剂量组>对照组(P<0.05),且瑞舒伐他汀组各过氧化、炎症指标均显著优于较高蛋氨酸组、叶酸组,高剂量组MDA、TNF-α、IL-8及MMP-9含量较低剂量组降低,GSH-PX活性则明显增强。一方面验证了Hcy参与AS的氧化应激反应,促进了AS的形成;另一方面说明瑞舒伐他汀较叶酸能更好地减弱Hcy对GSH-PX活性的抑制作用,加强氧化保护机制,抑制炎症反应,且其效应呈剂量相关性[8]。

有研究认为,血管内皮的损伤会对血管平滑肌细胞的可塑性造成影响,使其去分化为增殖型表型[9]。于海娇等[10]研究也发现,Hcy可以直接促进血管平滑肌细胞内膜下增殖,在AS的发病中有极其重要的地位。本研究中,高蛋氨酸组、叶酸组、低剂量组颈动脉内膜中膜厚度明显高于对照组、高剂量组(P<0.05)。说明瑞舒伐他汀对上述表型的转变具有抑制作用,抑制血管平滑肌异常增殖,且剂量越高,效果越明显。最新研究发现,MAPK信号通路与细胞增殖和迁移过程有关,而瑞舒伐他汀可能参与下调该信号通路的活性[11]。

综上所述,高剂量瑞舒伐他汀对HHcy性AS的疗效更佳,可达到更好的过氧化抑制作用,降低颈动脉血管平滑肌厚度的效果更好,但其具体的作用机制尚待于进一步研究。

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(本文编辑:刘斯静)

Influence of different doses rosuvastatin on peroxidation and proliferation of vascular smooth muscle cells for experimental atheriosclerosis rats

LIU Ai-ning1,YANG Wen-gang1,JU Shu-hong1,NIE Dan-feng1,ZHOU Hui2*
( 1. Department of Neurology,Putuo District Liqun Hospital of Shanghai,Shanghai 200333,China; 2. Department of Neurology,the Affiliated Changzheng Hospital of the Second Military Medical University of PLA,Shanghai 200003,China)

Objective To explore the influence of different doses rosuvastatin on peroxidation and proliferation of vascular smooth muscle cells for experimental atheriosclerosis rats.MethodsForty-six male rats were divided randomly into five groups,control group(n=6)was given with ordinary feed,high methionine group(n=10)with 2% methionine on this basis,folic acid group(n=10)with high methionine feed after four weeks,adding folic acid for lavage by 0.8 mg/kg per day,low dose group(n= 10)and high dose group(n=10)with high methionine feed after four weeks,adding rosuvastatin for lavage by 1 mg/kg per day,2 mg/kg per day,respectively.The rats were executed after last lavage for four hours to get blood and carotid artery.Plasma homocysteine(Hcy),content of plasma malondialdehyde (MDA),activity of glutathione peroxidase(GSH-PX)and inflammatory factors were detected,and the relative thickness of carotid artery walls was measured.ResultsAt12 weeks after modeling,the level ofplasma Hcy was significantly increased than before modeling,the order was high methionine group<folic acid<low dose group<high dose group<control group(P<0.05).The peroxide and inflammatory indexes in rosuvastatin group were significantly better than those of high methionine group.Compared with low dose group,content of MDA,tumor necrosis factor-α,interleukin 8 and matrix metalloproteinases 9 decreased,the activity of GSH-PX was significantly enhanced in high dose group(P<0.05).The relative thickness of carotid artery walls in high methionine,folic acid group and low dose group was obviously higher than that of control group,high dose group(P<0.05).ConclusionHigh dose of rosuvastatin has better effect of atherosclerosis caused by hyperhomocysteinemia,and can achieve better inhibitory effect on peroxide,decrease the thickness of artery vascular smooth muscle more remarkably.

arteriosclerosis;rosuvastatin;muscle,smooth

R543.5

A

1007-3205(2015)02-0133-04

2014-06-19;

2014-08-23

上海市普陀区卫生系统自主创新科技资助项目(KW-2012-02)

刘爱宁(1972-),女,山东烟台人,上海市普陀区利群医院副主任医师,医学硕士,从事脑血管疾病诊治研究。

*通讯作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2015.02.004

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