PKR、eIF-2α在IL-24诱导胶质瘤细胞凋亡中的作用研究

胡长伟，尹港峰，王希瑞，张文高，赵文清，李文玲

(1.河北省沧州市中心医院神经外三科，河北沧州061000;2.河北省人民医院功能神经外科，河北石家庄050051)

PKR、eIF-2α在IL-24诱导胶质瘤细胞凋亡中的作用研究

胡长伟1，尹港峰1，王希瑞1，张文高1，赵文清2，李文玲2

(1.河北省沧州市中心医院神经外三科，河北沧州061000;2.河北省人民医院功能神经外科，河北石家庄050051)

目的探讨白细胞介素24(interleukin-24，IL-24)对胶质瘤细胞凋亡的影响以及双链RNA蛋白激酶R (double-stranded RNA-dependent protein kinase，PKR)、真核细胞翻译起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF-2α)在其中的作用。方法 将载有IL-24基因的 Ad5F35型重组腺病毒(Ad-IL-24)及载有增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因作为对照的Ad5F35型重组腺病毒(Ad-EGFP)转染入胶质瘤细胞U87和U251中，应用流式细胞仪检测胶质瘤细胞U87和U251中的凋亡情况，并检测U87和U251各组中PKR、磷酸化PKR(phosphorylation-PKR，pPKR)、eIF-2α及磷酸化eIF-2α(phosporylation-eIF-2α，peIF-2α)的表达情况。结果在胶质瘤细胞U87和U251中转染IL-24后的细胞凋亡率为12.3%和13.0%，明显高于空白组与对照组，并且转染IL-24的胶质瘤细胞中PKR、pPKR、eIF-2α及peIF-2α的表达增加。结论IL-24可能在胶质瘤细胞中通过上调PKR、eIF-2α的表达及其活化，促进胶质瘤细胞凋亡。

神经胶质瘤;白细胞介素类;eIF-2激酶

白细胞介素24(interleukin-24，IL-24)是目前研究较广泛的一种肿瘤抑制因子，其在多种肿瘤中的抗癌特性已被证实。双链RNA蛋白激酶R(doublestranded RNA-dependent protein kinase，PKR)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，是干扰素所介导的抗病毒以及促使细胞凋亡功能的主要调解因子之一，它参与多种刺激因子介导的凋亡［1-2］。本研究探讨IL-24通过调控PKR的表达和活化，进而激活真核细胞翻译起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α，eIF-2α)，促进胶质瘤细胞凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1 胶质瘤细胞 人胶质瘤细胞U87与U251购自中国科学院上海细胞生物学研究所，用DMEM培养液在37℃、5%CO2培养箱中传代培养。

1.2 重组腺病毒 载有IL-24基因的重组腺病毒Ad5F35-IL24(Ad-IL-24)及载有增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因作为对照的Ad5F35型重组腺病毒(Ad-EGFP)由北京市本元正阳基因技术有限公司提供，Ad5F35-IL24病毒效价为2.8×1014pfu/L，Ad5F35-EGFP病毒效价为5.8×1014pfu/L。

1.3 细胞凋亡检测 将转染Ad-IL-24、Ad-EGFP及空白对照的胶质瘤细胞收集清洗后，分为IL-24组、对照组和空白组加用Annexin V和PI双染，然后进行流式细胞仪检测细胞凋亡情况。Annexin V阴性和PI阴性的细胞为正常细胞，Annexin V阳性和PI阴性的细胞为凋亡细胞;Annexin V阳性和PI阳性的细胞为坏死细胞。

1.4 Western blot检测 常规提取肿瘤细胞总蛋白，BCA法测量蛋白浓度，调整样品的总蛋白浓度为同一值。取各样本100μg蛋白，10%～12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺胶体电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分离，电泳后电转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，封闭后加入一抗IL-24(1∶1 000，美国Santa Cruz公司)、PKR、磷 酸化 PKR(phosphorylation-PKR，pPKR)、eIF-2α、磷酸化 eIF-2α(phosporylation-eIF-2α，peIF-2α)(1∶500)，以 GAPDH为内参，然后在HRP标记的二抗中孵育后显色，定影。采用美国UVP lab work 4.60图像分析系统软件进行半定量分析。

1.5 统计学方法 应用SPSS11.5统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 IL-24促进胶质瘤细胞的凋亡 在胶质瘤细胞U87中，转染Ad-IL-24的细胞凋亡率为12.3%，明显高于对照组的4.0%和空白组的3.0%(P＜0.05);而在U251细胞中，IL-24组的凋亡率为13. 0%，也明显高于对照组的5.4%和空白组的3.6% (P＜0.05)。这说明高表达的IL-24可以有效促进胶质瘤细胞的凋亡。见图1。

2.2 IL-24通过调节PKR和eIF-2α促进胶质瘤细胞凋亡 在转染Ad-IL-24的U87和U251胶质瘤细胞中，PKR和pPKR的表达明显高于对照组和空白组，并且作为PKR下游通路蛋白的eIF-2α及其活化形式的peIF-2α的表达在转染Ad-IL-24后明显增加。说明在胶质瘤细胞中IL-24的表达可能通过上调PKR及eIF-2α的表达和活化，促进细胞的凋亡增加。见图2。

图1 流式细胞仪检测U87和U251细胞系转染IL-24后细胞凋亡情况*P＜0.05与空白组、对照组比较(q检验)Figure 1 Flow cytometry detected the apoptosis rates of U87 and U251 cells after being transfected with IL-24

3 讨 论

胶质瘤的发生发展与多种细胞因子的异常表达有关，目前认为胶质细胞中抑癌基因的突变会造成抑癌因子表达的下调或缺失，从而引发一系列的细胞信号通路的改变，并最终引发细胞的癌变，成为胶质瘤细胞［3］。

图2 Western blot检测U87和U251细胞中转染IL-24后PKR与e IF-2α蛋白表达情况Figure 2 Western blotting detected the expression of PKR and eIF-2αin U87 and U251 untransfected transfected with IL-24

IL-24是一种新发现的具有抗肿瘤作用的细胞因子，系IL-10家族成员。最新的一些研究专注于IL-24/黑色素瘤分化相关因子 7(melanoma differentiation-associated gene-7，MDA-7)基因的抗癌作用。IL-24又名MDA-7基因是在研究恶性黑色素细胞瘤时发现。IL-24是一种具有细胞因子特性和抑瘤因子功能双重功效的蛋白质。正常生理浓度的IL-24参与调节免疫反应，而在超生理浓度下会显示非常好的抗肿瘤特性。近年来，在多种肿瘤中均有IL-24抑癌作用的研究［4-5］。

PKR是一种调节细胞凋亡的蛋白分子，目前发现PKR的活化可介导多种肿瘤细胞的凋亡增加，从而发挥抗肿瘤特性［6-8］。PKR基因定位于人染色体2p21-2，PKR基因是由一个含有许多潜在调控元件的启动子所转录，通过2个双链RNA绑定区域被激活［9］。激活的PKR可以调控多个下游靶位，其中包括eIF-2α、核因子κB，可以抑制蛋白的合成，最后抑制细胞的生长和促进细胞凋亡［10-13］。

本研究将IL-24转染入胶质瘤细胞中，发现转染IL-24的细胞凋亡率明显增高，这说明IL-24可以促进胶质瘤细胞的凋亡。有研究发现，在肺癌细胞中IL-24可上调PKR的表达，从而增加肺癌细胞的凋亡率，发挥抑制肺癌细胞作用［14］。本研究发现，在IL-24高表达的胶质瘤细胞中PKR和pPKR的表达均增高，eIF-2α和peIF-2α的表达同样是增加的。eIF-2α是PKR下游调节细胞凋亡的重要通路信号蛋白。因此，我们认为在胶质瘤细胞中，IL-24可通过上调PKR的表达及活化增加下游eIF-2α的表达与活化，从而促进细胞的凋亡。

［1］García MA，Meurs EF，Esteban M.The dsRNA protein kinasePKR:virus and cell control［J］.Biochimie，2007，89(6/ 7):799-811.

［2］夏君.抗病毒蛋白PKR的结构和功能［J］.中国免疫学杂志，2013，29(2):205-209.

［3］赵文清，李文玲，张学新，等.胶质母细胞瘤中 p16、RB、cyclinD1、CDK4基因表达异常的研究［J］.河北医科大学学报，2002，23(6):332-334.

［4］Park MA，Hamed HA，Mitchell C，et al.A serotype 5/3 adenovirus expressing MDA-7/IL-24 infects renal carcinoma cells and promotes toxicity of agents that increase Ros and ceramide levels［J］.Mol Pharmacol，2011，79(3):368-380.

［5］Chang S，Yang J，Chen W，et al.Antitumor activity of an adenovirus harboring human IL-24 in colon cancer［J］.Mol Biol Rep，2011，38(1):395-401.

［6］徐扬，王建，辛晓燕，等.siRNA靶向抑制PKR基因及其对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响［J］.西南国防医药，2010，20(5): 465-467.

［7］Montero H，Trujillo-Alonso V.Stress granules in the viral replicationcycle［J］.Viruses，2011，3(11):2328-2338.

［8］del Castillo CS，Hikima J，Ohtani M，et al.Characterization and functional analysis of two PKR genes in fugu(Takifugu rubripes)［J］.Fish Shellfish Immunol，2012，32(1):79-88.

［9］Lee SB，Esteban M.The interferon-induced double stranded RNA activated protein kinase induces apoptosis［J］.Virology，1994，199(2):491-496.

［10］Saelens X，Kalai M，Vandenabeele P.Translation inhibition in apoptosis:caspase-dependent PKR activation and eIF2-α phosphorylation［J］.J Biol Chem，2001，276(45):41620-41628.

［11］Sudhakar A，Ramachandran R，Ghosh S，et al.Phosphorylation of serine 51 in initiation factor 2alpha(eIF2 alpha)promotes complex formation between eIF2alpha(P) and eIF2Bcauses inhibition in the guaninenucleotide exchange activity of eIF2B［J］.Biochemistry，2000，39(42):129-138.

［12］罗远材，瞿全新，糜若然.宫颈病变组织中PKR、p-PKR、p-EIF2α表达及意义［J］.天津医药，2010，38(1):20-22，后插1.

［13］Freidrich I，Ben-Bassat H，Levitzki A.Activation of dsRNA dependentprotein kinase PKR in Karpas299 does not lead to celldeath［J］.Cancer Biol Ther，2005，4(7):734-739.

［14］Pataer A，Vorburger SA，Barber GN，et al.Adenoviral transfer of the melanomadifferentiation-associated gene 7(mda7)induces apoptosis of lung cancer Cells via up-regulation of thedoublestranded RNA-dependent protein kinase(PKR)［J］.Cancer Res，2002，62(8):2239-2243.

(本文编辑:刘斯静)

Role of PKR and eIF-2α in apoptosis of glioma induced by IL-24

HU Chang-wei1，YIN Gang-feng1，WANG Xi-rui1，ZHANG Wen-gao1，ZHAO Wen-qing2，LI Wen-ling2
( 1． Third Department of Neurosurgery，Cangzhou Central Hospital，Hebei Province， Cangzhou 061000，China; 2． Department of Functional Neurosurgery，Hebei General Hospital，Shijiazhuang 050051，China)

Objective To investigate the regulation of interleukin-24(IL-24)indouble-stranded RNA-dependent protein kinase(PKR)，eukaryotic initiation factor 2α(eIF-2α)-induced apoptosis of glioma cells.MethodsAdenovirus Ad5F35-IL24(Ad-IL-24)and the control virus Ad5F35-enhanced green fluorescent protein(Ad-EGFP)were transfected into U87 and U251 glioma cells.Then，U87 and U251 glioma cell apoptosis were tested using flow cytometry，and the expression of PKR，phosphorylation-PKR(pPKR)，eIF-2αand phosporylation eIF-2α(peIF-2α)in U87 and U251 of different groups were detected by western blot.Results The cell apoptosis rates were significantly increased to 12.3%and 13.0%in U87 and U251 glioma cells after being transfected with IL-24，and the expression of PKR，pPKR，eIF-2αand peIF-2α increased after being transfected with IL-24 in glioma cells.ConclusionIL-24 may regulate PKR，eIF-2α expression and activation to promote apoptosis of glioma cells.

glioma;interleukins;eIF-2 kinase

R730.264

A

1007-3205(2015)02-0141-03

2014-08-22;

2014-10-31

胡长伟(1980-)，男，蒙古族，河北省沧州市中心医院主治医师，医学硕士，从事神经外科疾病诊治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2015.02.007