α-硫辛酸对戊四氮点燃大鼠认知功能的保护作用及机制探讨

赵冉冉，徐晓臣，檀国军，王维平*，张文忠，刘吉祥

（1.河北省邯郸市第一医院急诊科，河北邯郸056002;2.河北医科大学第二医院神经内科，河北石家庄050000; 3.河北省邯郸市第一医院神经内科，河北邯郸056002;4.河北邯郸市第一医院神经外科，河北邯郸056002）

α-硫辛酸对戊四氮点燃大鼠认知功能的保护作用及机制探讨

赵冉冉1，2，徐晓臣3，檀国军2，王维平2*，张文忠1，刘吉祥4

（1.河北省邯郸市第一医院急诊科，河北邯郸056002;2.河北医科大学第二医院神经内科，河北石家庄050000; 3.河北省邯郸市第一医院神经内科，河北邯郸056002;4.河北邯郸市第一医院神经外科，河北邯郸056002）

目的 观察α－硫辛酸（alpha－lipoic acid，ALA）对戊四氮（pentylenetetrazole，PTZ）点燃大鼠认知功能的保护作用，并探讨其机制。方法 选取36只健康成年雄性SD大鼠随机分为对照组、癫痫组和治疗组，每组12只。癫痫组和治疗组给予PTZ隔日腹腔注射建立PTZ点燃模型，治疗组同时给予ALA腹腔注射，利用Morris水迷宫（Morris water maze，MWM）检测动物空间学习、记忆能力，采用分光光度法检测海马组织中丙二醛（malondialdehyde，MDA）和还原性谷胱甘肽（glutathione，GSH），2＇，7＇－二氯荧光素二乙酸酯（2＇，7＇－dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH－DA）探针检测脑组织中活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的变化。结果 随着水迷宫训练进行，各组大鼠逃避潜伏期呈逐渐下降趋势，但癫痫组逃避潜伏期时间下降幅度最小，治疗组逃避潜伏期下降幅度较癫痫组更明显。癫痫组在目标象限停留时间显著缩短，海马组织中MDA和ROS明显增高，GSH含量明显降低（P＜0.05）;治疗组与癫痫组相比，目标象限停留时间明显延长，海马组织中ROS和MDA含量明显降低，GSH含量明显升高（P＜0.05）。结论 氧化应激在癫痫中有非常重要的作用，ALA抗氧化治疗能够减轻脑组织中氧化应激损伤，改善癫痫大鼠的认知功能，为癫痫的治疗提供了新的思路。

癫痫;戊四唑;硫辛酸;认知

1 材料与方法

1.1 实验动物分组和模型制备 健康雄性SD大鼠36只，体质量250～290 g，河北省实验动物中心提供，按照随机数字表法分为对照组、癫痫组和治疗组，每组 12只;对照组每日腹腔注射生理盐水1 mL/kg，癫痫组和治疗组给予 PTZ腹腔注射35 mg/kg，1次/d，共30 d。依据Racine分级标准［5］观察大鼠痫样发作的等级。30 d后，治疗组大鼠每天给予ALA 50 mg/kg腹腔注射，癫痫组给予等量生理盐水腹腔注射，共给予14 d。

1.2 Morris水迷宫试验 于实验后第45天起行Morris水迷宫试验，第45～49天为定位航行试验，可测试大鼠的学习能力，每天按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限顺序分别设定4个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，记录大鼠从入水起至爬上平台所花费的时间为逃避潜伏期，120 s后仍未找到平台的将逃避潜伏期记录为120 s，并将大鼠引上平台停留30 s，间隔20 min后将大鼠从下一个象限入水点放入水中并记录逃避潜伏期，取4次不同象限的逃避潜伏期平均值为当日的逃避潜伏期值。第50天为空间探索试验，可检测大鼠的记忆能力，将平台撤去，记录大鼠2 min内为搜索平台、停留在平台所在象限的时间（目标象限停留时间）。

1.3 活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）检测 Morris水迷宫试验结束后每组大鼠各取6只，麻醉后断头取脑，冰盘上快速分离海马，用眼科剪将海马组织剪碎，轻轻研磨组织后经300目筛网过滤，制备单细胞悬液，然后在室温下4 000 r/min离心3 min，弃上清后加入二氯二氢荧光素－乙酰乙酸酯（2＇，7＇－dichlorofluorescin diacetate，DCFH－DA）工作液，37℃避光孵育20 min后应用FACS AriaⅡ流式细胞仪，每个样本收集104个细胞，以DCF的荧光强度作为ROS含量值。

1.4 丙二醛（malondialdehyde，MDA）和还原性谷胱甘肽（glutathione，GSH）检测 Morris水迷宫试验结束后每组各取6只大鼠，麻醉后断头取脑，冰盘上快速分离取海马，液氮速冻后－80℃保存，用于检测MDA和GSH含量，实验步骤按照试剂盒说明书进行。

1.5 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，分别采用重复测量设计资料的方差分析、单因素方差分析和q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 痫样发作情况 大鼠注射PTZ后于第5天起出现凝视、反复洗脸、点头样动作，症状逐渐加重，最终出现全身强直－阵挛样发作。停止PTZ注射后未再出现癫痫发作，对照组无癫痫发作。

2.2 大鼠学习记忆能力的改变 Morris水迷宫结果提示，随着水迷宫训练进行，各组大鼠逃避潜伏期呈逐渐下降趋势，但癫痫组逃避潜伏期时间下降幅度最小，各组在组间、时点间以及组间·时点间交互作用差异均有统计学意义（P＜0.01）。各组间目标象限停留时间差异有统计学意义（P＜0.01）。两两比较后发现，癫痫组大鼠逃避潜伏期较对照组明显延长（P＜0.05），目标象限停留时间较对照组明显缩短（P＜0.05）;治疗组大鼠与癫痫组相比逃避潜伏期明显缩短（P＜0.05），目标象限停留时间明显延长（P＜0.05）。见表1。

表1 α-硫辛酸对Morris水迷宫表现的影响Table 1 Effects of ALA on Morris water maze performance （n=6，±s，s）

表1 α-硫辛酸对Morris水迷宫表现的影响Table 1 Effects of ALA on Morris water maze performance （n=6，±s，s）

*P＜0.05与对照组比较 #P＜0.05与癫痫组比较（q检验）

目标象限逃避潜伏期组别停留时间对照组 65.13±7.21 53.26±4.32 33.68±3.11 18.16±1.6 45 d 46 d 47 d 48 d 49 d 0 7.50±0.38 40.11±4.01癫痫组 69.66±6.56 59.41±4.12 46.17±3.47 39.61±3.21 29.56±2.25 15.31±0.98*治疗组 64.11±5.86 54.61±5.76 39.71±3.31 21.36±1.67 11.01±1.03 28.12±1.36#＜0.01组间时点间组间·时点间F=77.913 P＜0.01F=729.411 P＜0.01F=20.791 P＜0.01F=55.812P

2.3 大鼠海马组织中氧化应激参数的改变 癫痫组大鼠海马组织中ROS和MDA的含量较对照组明显升高（P＜0.05）;治疗组较癫痫组显著下降（P＜0.05），但仍明显高于对照组（P＜0.05）。癫痫组大鼠海马组织中GSH的含量较对照组明显下降（P＜0.05）;治疗组较癫痫组明显增加（P＜0.05），但仍低于对照组（P＜0.05）。见表2。

表2 α-硫辛酸对海马组织中ROS、MDA和GSH水平的影响Table 1 Effects of ALA on levels of ROS，MDA and GSH in the hippocam pus （n=6，±s）

表2 α-硫辛酸对海马组织中ROS、MDA和GSH水平的影响Table 1 Effects of ALA on levels of ROS，MDA and GSH in the hippocam pus （n=6，±s）

*P＜0.05与对照组比较 #P＜0.05与癫痫组比较（q检验）

组别 ROS MDA（nmol/mg） GSH（mg/g） 1.00±0.09 7.31±0.61 46.89±4.32癫痫组 3.01±0.22* 22.76±2.11* 20.32±1.98*治疗组 1.91±0.12*# 13.34±1.07*# 34.96±3.23*#F对照组0.001 0.001 0.001 433.187 130.319 101.201P

3 讨 论

氧化应激指体内氧化和抗氧化系统失衡，使机体内ROS生成过多或消除减少，体内过多的ROS参与了脂质过氧化和DNA的损伤，从而导致细胞功能受损。在多种癫痫动物模型脑组织中均存在有脑内MDA升高、GSH耗竭、DNA损伤及各种亚细胞器结构破坏［6］，尤其是造成线粒体的损伤，线粒体损伤后出现细胞功能障碍，导致离子交换异常，继而出现海马硬化、神经元数量的减少、胶质细胞活化等癫痫特征性病理改变。提示氧化应激在癫痫的发生发展中起到了重要的作用［7］。既往的动物研究中发现，通过降低氧化应激损伤的程度，能够明显降低癫痫大鼠的痫性发作等级，证实抗氧化药物可能是治疗癫痫的新的途径［8］。PTZ点燃模型是用亚抽搐剂量的PTZ重复进行腹腔注射，导致大鼠痫性发作等级逐渐升高直至大发作，PTZ点燃模型模拟了人类癫痫的特征，具有反复发作的特点，大鼠PTZ点燃模型同时具有认知功能障碍，是筛选治疗癫痫药物的理想模型。本研究结果显示，PTZ点燃癫痫模型大鼠脑内ROS水平升高，MDA升高，GSH下降，存在氧化应激损伤。证实氧化应激在癫痫中起重要作用，为临床应用抗氧化治疗提供了实验依据。

ALA具有独特双硫键的抗氧化分子结构，为天然强效抗氧化剂，ALA进入细胞后转化为还原型二氢硫辛酸，抗氧化能力进一步增强［9］。ALA在抗氧化及糖代谢等方面的作用已引起高度关注，作为神经保护剂应用于糖尿病多发周围神经病等多种神经系统疾病的治疗，具有给药方便、依从性好、安全性高的优势。在多发性硬化［10］、脑卒中［11］、阿尔茨海默病［12］的动物模型中，均发现ALA具有神经保护和治疗作用。除了抗氧化能力之外，ALA还能够改善中枢胆碱能系统功能，增加脑内乙酰胆碱水平，保护认知功能［9］。本研究结果显示，PTZ点燃癫痫模型大鼠痫性发作等级逐渐升高，癫痫模型成功建立，Morris水迷宫试验提示癫痫大鼠伴有认知功能损害，ALA显著改善了大鼠的空间学习和记忆能力。这可能是通过降低脑内ROS水平和脂质过氧化标记物MDA含量、提高具有抗氧化能力的GSH水平等抗氧化应激机制实现的。抗氧化策略有可能成为治疗癫痫中认知功能障碍的新途径。

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（本文编辑：赵丽洁）

Protective effect of alpha-lipoic acid on cognitive impairment induced by pentylenetrazole-induced kindling in rats

ZHAO Ran－ran1，2，XU Xiao－chen3，TAN Guo－jun2，WANG Wei－ping2*，ZHANG Wen－zhong1，LIU Ji－xiang4
（ 1． Department of Emergency，the First Hospital of Handan City，Hebei Province，Handan 056002，China; 2． Department of Neurology，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang，050000，China; 3． Department of Neurology，the First Hospital of Handan City，Hebei Province，Handan 056002，China; 4． Department of Neurosurgery，the First Hospital of Handan City，Hebei Province，Handan 056002，China）

Objective To explore the protective effect of alpha－lipoic acid（ALA）on cognitive function in an epilepsy model by pentylenetetrazole（PTZ）－kindling and the mechanism.MethodsThe healthy adult male 36 SD rats were randomly assigned into three groups：control group，PTZ group，and drug therapy group（12 rats，each group）.PTZ and drug therapy groups were injected intraperitoneally with PTZ to establish PTZ－kindling model.ALA was injected intraperitoneally in the drug therapy group.Morris water maze was used to evaluate spacial learning and memory function.Spectrophotometry was used to detect the levels of malondialdehyde and glutathione，2＇，7＇－dichlorodihydrofluoresce in diacetate probewas used to detect the level of reactive oxygen species in the hippocampi of the rats.ResultsIn the Morris water maze，all animals showed a progressive decline in the escape latency with training.The rats in PTZ group exhibited a significant prolongation of escape latency.In PTZ group，the escape latency was significantly prolonged（P＜0.05）and time spent in the target quadrant was shortened（P＜0.05），ROS and MDA significantly increased（P＜0.05），but GSH significantly decreased（P＜0.05）.However，administration of ALA significantly improved the performance in MWM，and decreased the contents of ROS and MDA，increased the level of GSH.ConclusionOxidative stress plays an important role in the pathogenesis of epilepsy，ALA can effectively protect cognitive function and ameliorate oxidative damage，which provides a new way for treating cognitive impairment induced by epilepsy.

epilepsy;pentylenetetrazole;thioctic acid;cognition癫痫是常见的神经系统疾病，以发作性、重复性、刻板性发作为特征，可导致严重的神经结构和功能改变，损害患者的认知功能，给患者和家庭带来沉重的负担。一次痫性发作是短暂的，而癫痫带来的认知功能损伤则是长期存在的，且随着病情的加重而不断恶化，带来比痫性发作更加严重的后果［1］。现有的大多数抗癫痫药物不仅没有改善认知功能，反而进一步损伤认知功能［2］，因此寻找能够改善癫痫认知功能的药物已迫在眉睫。癫痫的发病机制还未完全阐明，近年来认为氧化应激在癫痫的发生发展中具有重要的作用［3］，与此同时，研究发现氧化应激损伤与认知障碍也有密切联系［4］。抗氧化策略有可能是改善癫痫认知功能的有效方法。α－硫辛酸（alpha－lipoic acid，ALA）是一种兼具脂溶性和水溶性的天然强效抗氧化剂，在临床上用于治疗糖尿病周围神经病变，对多发性硬化、缺血再灌注损伤、阿尔茨海默病等疾病有显著的保护作用。ALA对于癫痫的认知障碍是否具有保护作用还未见报道。本研究观察ALA对戊四氮（pentylenetetrazole，PTZ）点燃大鼠认知功能的保护作用，旨在为癫痫认知功能的改善提供新的思路。

R742.1

A

1007－3205（2015）03－0257－04

2014－11－05;

2014－12－10

河北省医学科学研究重点课题计划（20090371）;河北省科学技术研究与发展指导计划项目（11276425）

赵冉冉（1983－），女，河北邯郸人，河北省邯郸市第一医院主治医师，医学博士研究生，从事癫痫和认知研究。

*通讯作者。E－mail：a34251900@163.com

10.3969/j.issn.1007－3205.2015.03.003