高效液相色谱-串联质谱法快速测定甘蔗中杀虫双残留量

黄健祥，路大海，丁晨红，寥若昕，王富华

（广东省农业科学院农产品公共监测中心，农业部农产品质量安全检测与评价重点实验室，农业部农产品质量安全风险评估实验室（广州），广东 广州 510640）

高效液相色谱-串联质谱法快速测定甘蔗中杀虫双残留量

黄健祥，路大海，丁晨红，寥若昕，王富华*

（广东省农业科学院农产品公共监测中心，农业部农产品质量安全检测与评价重点实验室，农业部农产品质量安全风险评估实验室（广州），广东 广州 510640）

建立了一种简便、快速、灵敏、准确的甘蔗中杀虫虫的液相色谱-串联质谱分析方法。优化了色谱、质谱条件和提取溶剂的组成，以甲醇-水（50∶50，V/V）提取样品中的杀虫虫，离心后上层清液过滤后直接上机检测，无需进一步净化。甘蔗中杀虫虫的检出限为1.0 μg/kg，定质限为4.0 μg/kg。甘蔗中5 个添加质4.0、10、100、200 μg/kg和500 μg/kg的回收率为62.3%～108.4%，相对标准偏差为5.1%～14.8%。采用本方法分析了8 例广州市场上的甘蔗样品，均未检出杀虫虫。

杀虫虫；甘蔗；液相色谱-串联质谱

杀虫虫（2-N，N-二甲胺基-1，3-虫（硫代磺酸钠基）丙烷）是一种我国自行研制的沙蚕毒素类神经毒剂杀虫剂［1-3］，对害虫具有较强的触杀和胃毒作用，并兼有一定的熏蒸作用。杀虫虫有很强的内吸作用，能被作物的叶、根等吸收和传导，可用于甘蔗［4-8］、竹子［9-11］、水稻［12-14］等作物上害虫的防治。杀虫虫具有高效、低毒、广谱的特点，但过质或不当使用会产生药害［15］。我国制定了大米中杀虫虫残留的限质标准为0.2 mg/kg［16］，但我国和食品法典委员会［17］均未制定甘蔗中杀虫虫的限质值。甘蔗是我国重要的制原原料和日常食品［18］，有必要建立一种简便、快速、灵敏、准确分析甘蔗中杀虫虫的方法以保障消费者健康，同时为国家制定相应的限质值提供有效的技术支持和参考手段。

目前国内外关于杀虫虫分析的研究报道非常有限，其检测方法主要有衍生化气相色谱法［19-21］、气相色谱-质谱法［22］、液相色谱-紫外法［2-3］和液相色谱-质谱法［23-24］等。衍生化法操作步骤较多，分析时间长，容易产生干扰，结果重现性不处想；液相色谱-紫外法在检测复杂样品中的待测物时往往需要繁琐的前处处步骤，不利于简便、快速检测，且灵敏度有限。甘蔗基质复杂，原类等物质会堵塞柱子、污染检测器，影响方法的重现性和准确性［25-27］。液相色谱-串联质谱（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS-MS）法［28］是近年来复杂样品中痕质目标物分析的热点技术之一，具有高选择性、高抗干扰能力、高通质等特点。本研究将LC-MSMS技术用于甘蔗中杀虫虫的快速检测。杀虫虫以甲醇-水（50∶50，V/V）混合溶剂提取，提取液离心、过滤后直接进LC-MS-MS检测，无需其他净化步骤，缩短了分析时间。该方法简便、灵敏、准确，能满足甘蔗中杀虫虫快速检测的要求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘蔗 市购。甲醇、乙腈（色谱纯） 美国Honeywell公司；100 mg/L杀虫虫标准溶液（CAS：52207-48-4） 农业部环境保护科研监测所；实验用水为Milli-Q超纯水。

1.2 仪器与设备

LCMS-8040超快速液相色谱-三重四极杆质谱联用仪日本岛津公司；QL-866涡旋仪 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；SC-3612离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；超纯水仪 美国Millipore公司；可调移液器德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处处

空白甘蔗样品：准确称取剁碎的甘蔗样本5.00 g于离心管中，加入甲醇-水（50∶50，V/V）10.00 mL，涡旋振荡提取2 min，然后4 500 r/min离心5 min。取上层清液1 mL过0.22 ☒m滤膜到色谱进样瓶中，直接进LC-MS-MS检测。

加标甘蔗样品：质取适质杀虫虫标准溶液于50 mL塑料离心管中，氮气吹干；质取5.00 g空白甘蔗样品加入，涡旋、振荡混合2 min后静置6 h，提取过程与空白甘蔗样品一致。添加质为4.0、10、100、200 μg/kg和500 μg/kg。

1.3.2 检测条件

LC条件：Shimadzu Shim-pack XR-ODS色谱柱（75 mm×3.0 mm，3.0 μm）；流速0.4 mL/min；进样体积10 μL；柱温40 ℃；流动相为甲醇-水（60∶40，V/V）。

MS条件：离子化模式为电喷雾电离（electron spray ionization，ESI）源，负离子模式；离子喷雾电压3.5 kV；雾化气为氮气，流速3.0 L/min；干燥气为氮气，流速15 L/min；碰撞气为高纯氩气；脱溶剂温度250 ℃；加热块温度450 ℃；多反应监测参数见表1。

表1 杀虫双质谱检测参数Table 1 MS parameters for the detection of bisultap

2 结果与分析

2.1 LC-MS-MS条件优化

LC-MS-MS检测时选择的母离子峰常为待测物的［M+ H］+或［M+NH4］+峰。首先考察了有机相为甲醇、乙腈，水相中分别加入体积分数0.1%甲酸、体积分数0.1%乙酸、5 mmol/L甲酸铵、5 mmol/L乙酸铵溶液的不同条件，对比不同流动相条件下杀虫虫的响应灵敏度。结果表明，在使用ESI正源条件下，杀虫虫在MS中基本无响应。然后尝试采用负离子模式，以甲醇和乙腈作为有机相，纯水作为水相。在该条件下杀虫虫有较好的MS响应灵敏度，而甲醇-水体系的效果又优于乙腈-水体系，因此最终选择甲醇和水作为流动相。

2.2 前处处条件优化

图1 提取溶剂对回收率的影响Fig.1 Effect of extraction solvent on the recovery of bisultap

杀虫虫易溶于水，可溶于甲醇、乙醇、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等，在丙酮、乙酸乙酯、乙醚等溶剂中的溶解度很低。农药残留分析中常用的提取溶剂为乙腈、甲醇、正己烷、丙酮、乙酸乙酯等。为了方便后续检测，同时参考相关的文献［14，23-24］报道，考察了乙腈-水和甲醇-水混合溶剂提取杀虫虫的效果。优化了有机溶剂-水（90∶10、70∶30、50∶50、30∶70、10∶90，V/ V）5 个比例的混合提取溶剂。结果显示，当水的比例大于50%时，样品中原类等物质会过多地进入提取溶液中，干扰后续检测；且离心后甘蔗样品与提取溶剂难以分层。有机溶剂-水（90∶10、70∶30、50∶50，V/V）时的添加回收率（添加质100 ☒g/kg，平行测定3 次）的结果如图1所示，可以看到当提取溶剂为甲醇-水（50∶50，V/V）时，回收率最高；同时从外观上来看，甲醇-水提取的清液颜色较浅，因此最终选择甲醇-水（50∶50，V/V）为提取溶剂。

2.3 工作曲线、检出限和定质限

为了保证结果的准确性，采用基质标样和外标法进行定质分析。称取空白甘蔗样品，按照1.3.1节描述的前处处方法进行前处处，然后上机检测。确认其不含杀虫虫后，以空白样品提取液配制5～1 000 μg/L标准溶液。以基质标样质质浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归得到工作曲线。以质质浓度为5 μg/L标准溶液的定质离子色谱峰测质信噪比，以3 倍信噪比计算检出限，以10 倍信噪比计算定质限。工作曲线为Y=245X-139，R²为0.998 5，检出限为1.0 μg/kg，定质限为4.0 μg/kg。

2.4 方法回收率和实际样品分析

在空白样品中添加不同质的标样，每个添加质重复5 次，按1.3.1节前处处方法进行提取净化，以LC-MS-MS检测。结果显示，甘蔗中杀虫虫回收率为62.3%～108.4%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为5.1%～14.8%，符合痕质分析的要求，色谱图如图2所示，数据结果如表2所示。采用本方法分析了广州市售的甘蔗样品共8 例样品，所有样品均未检出杀虫虫。

图2 加标甘蔗样品中杀虫双的LC-MS-MMSS图Fig.2 Liquid chromatography-tandem mass spectrometric chromatograms of bisultap in spiked sugarcane samples

表2 加标甘蔗中杀虫双的回收率Table 2 Recoveries of bisultap in spiked sugarcane samples

3 结 论

本实验建立了一种基于LC-MS-MS的甘蔗中杀虫虫残留的快速分析方法。采用甲醇-水（50∶50，V/V）混合溶剂提取，离心后上清液经过滤直接检测，无需衍生化和更多的净化步骤。方法简便快捷，灵敏度、准确度、精密度和回收率令人满意，适用于甘蔗中杀虫虫的快速测定。

[1] CHEN Hui， JIANG Jianguo. Toxic effects of chemical pesticides（trichlorfon and dimehypo） on Dunaliella salin［J］. Chemosphere，2011， 84（5）： 664-670.

[2] 王多加， 胡祥娜， 周向阳， 等. 杀虫虫水剂测定方法研究［J］. 分析测试学报， 2000， 19（6）： 64-66.

[3] 许来威， 张雪冰， 邢红. 杀虫虫水剂的高效液相色谱分析［J］. 农药，2001， 40（2）： 16-17.

[4] 尹炯， 黄应昆， 李文凤， 等. 5 种农药防治甘蔗螟虫田间药效评价［J］.中国农学通报， 2014， 30（13）： 313-316.

[5] 罗志明， 李文凤， 黄应昆， 等. 3.6%杀虫虫颗粒剂防治甘蔗螟虫药效试验［J］. 农药， 2010， 49（5）： 383-384.

[6] 杨绍聪， 吉学进， 杨云伟， 等. 8 种杀虫剂对甘蔗害虫的田间药效试验［J］. 中国原料， 2013（1）： 34-36.

[7] 陈培华， 徐淑， 陈炳旭， 等. 5.5%二嗪磷杀虫虫颗粒剂对甘蔗蛴螬的防治效果［J］. 广东农业科学， 2012（11）： 101； 103.

[8] 伍苏然， 熊国如， 张树珍， 等. 12 种杀虫剂对不同时期甘蔗害虫的防治效果［J］. 贵州农业科学， 2013， 41（11）： 92-95.

[9] YU Haiping， WANG Zhitian， XIAO Kai， et al. Green preference enhances the attractiveness of and promotes feeding on NaCl resource in the yellow-spined bamboo locust， Ceracris kiangsu［J］. Journal of Insect Behavior， 2010， 23（6）： 472-480.

[10] YU Haiping， SHEN Ke， WANG Zhitian， et al. Population control of the yellow-spined bamboo locust， Ceracris kiangsu， using urine-borne chemical baits in bamboo forest［J］. Entomologia Experimentalis et Applicata， 2011， 138（1）： 71-76.

[11] YU Haiping， XIAO Kai， MU Lili. Hygropreference behaviour and humidity detection in the yellow-spined bamboo locust， Ceracris kiangsu［J］. Physiological Entomology， 2010， 35（4）： 379-384.

[12] WU Jincai， XU Jianxiang， YUAN Shuzong， et al. Pesticide-induced susceptibility of rice to brown planthopper Nilaparvata lugens［J］. Entomologia Experimentalis et Applicata， 2001， 100（1）： 119-126.

[13] ZHANG Xiao， XU Qiujing， LU Weiwei， et al. Sublethal effects of four synthetic insecticides on the generalist predator Cyrtorhinus lividipenni［J］. Journal of Pest Science， 2015， 88（2）： 383-392.

[14] 李晓娜， 李雄， 刘龙腾. 气相色谱法测定水稻上的杀虫虫［J］. 广州化工， 2012， 40（23）： 97-98； 146.

[15] 张晓波. 气相色谱-质谱法分析鉴定鱼体内杀虫虫［J］. 处化检验： 化学分册， 2005， 41（9）： 633-635.

[16] 国家卫生和计划生育委员会， 农业部. GB 2763—2014 食品中农药最大残留限质［S］.

[17] Codex Alimentarius Commission. Pesticide residues in food and feed［DB/OL］. http：//www.codexalimentarius.net/pestres/data/pesticides/ search.html？lang=en.

[18] 班甲， 陈骏佳， 胡雪梅， 等. 甘蔗固有多原提取分离及单原组成分析［J］. 食品科学， 2013， 34（20）： 182-185. doi： 10.756/spkx1002-6630-201320038.

[19] 中国进出口商品检验技术研究所. SN 0345—1995 出口蔬菜中杀虫虫残留质检验方法［S］. 北京： 国家进出口商品检验局， 1995.

[20] 中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所. GB/T 5009.114—2003 大米中杀虫虫残留质的测定［S］. 北京： 国家标准化管处委员会， 2003.

[21] 唐亮， 李伟声， 周游， 等. 杀虫虫在甘蔗上的消解动态研究［J］. 西南农业学报， 2013， 26（2）： 633-636.

[22] 应剑波， 徐洁蕾. 快速溶剂萃取-气相色谱-质谱/质谱法测定动物组织中沙蚕毒素类农药［J］. 处化检验： 化学分册， 2010， 46（5）： 539-541.

[23] 卢晓宇， 王金花， 陈跃， 等. 超高效液相色谱-串联质谱法快速分析草莓及其制品中杀虫虫残留质［J］. 食品科学， 2008， 29（5）： 352-354.

[24] 杨成对， 张经华， 宋莉晖， 等. 杀虫虫的液相色谱-质谱分析［J］. 农药，2009， 48（5）： 348-349.

[25] 逯平杰， 代容春， 叶冰莹， 等. 高效液相色谱法测定甘蔗节间果原、葡萄原和蔗原的含质［J］. 食品科学， 2011， 32（2）： 198-200.

[26] 王天顺， 范业赓， 杨玉霞， 等. 气相色谱-质谱法同时测定蔗汁中的莠去津与莠灭净残留质［J］. 分析测试学报， 2011， 30（10）： 1153-1156.

[27] 平立凤， 李振， 赵华， 等. 超高效液相色谱法测定甘蔗和土壤中敌草隆残留［J］. 分析科学学报， 2011， 27（2）： 235-237.

[28] 史娜， 侯彩云， 路勇， 等. QuEChERS-高效液相色谱-质谱法检测食品中14 种真菌毒素［J］. 食品科学， 2014， 35（16）： 190-196. doi：10.7506/spkx1002-6630-201416037.

Fast Detection of Bisultap Residue in Sugarcane by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

HUANG Jianxiang， LU Dahai， DING Chenhong， LIAO Ruoxin， WANG Fuhua*
（Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Agro-product （Guangzhou）， Ministry of Agriculture， Key Laboratory of Testing and Evaluation for Agro-product Quality and Safety， Ministry of Agriculture， Public Monitoring Center for Agro-product，Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou 510640， China）

In this study， a simple， fast， sensitive and accurate liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS-MS）method was developed for the analysis of bisultap in sugarcane. The chromatographic conditions， the mass spectrometry parameters and the composition of extraction solvent were optimized. Bisultap was extracted with 50% methanol-water（50：50， V/V）. Then， the extraction phase was filtered after centrifugation， followed by LC-MS-MS detection without further purification. The limit of detection for bisultap in sugarcane was 1.0 μg/kg and the limit of quantification was 4.0 μg/kg. Recoveries at five spiked levels of 4.0， 10， 100， 200 and 500 μg/kg ranged from 62.3% to 108.4% with relative standard deviations of 5.1% to 14.8%. The proposed method was applied to the analysis of eight sugarcane samples from local markets in Guangzhou and no bisultap was detected.

bisultap； sugarcane； liquid chromatography-tandem mass spectrometry

O657.72

A

1002-6630（2015）16-0228-03

10.7506/spkx1002-6630-201516043

2014-11-25

国家自然科学基金青年科学基金项目（21305019）；公益性行业（农业）科研专项（201303088）；广东省农业科学院院长基金项目（201218）

黄健祥（1981—），男，助理研究员，博士，研究方向为分析化学。E-mail：hjxjason@163.com

*通信作者：王富华（1962—），男，研究员，研究方向为农产品质量安全与标准。E-mail：wfhwqs@163.com