松茸菌汤熬制工艺参数优化及风味成分分析

王慧清，马 栋，吴素蕊，明 建，*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223）

松茸菌汤熬制工艺参数优化及风味成分分析

王慧清1，马 栋1，吴素蕊2，明 建1，*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223）

以云南产新鲜松茸菌为主要原料，研究松茸菌汤熬制的主要工艺参数。以菌汤中固形物溶出率和蛋白质溶出率为考察指标，通过单因素试验和正交试验分析和讨论，确定松茸菌汤熬制工艺参数，并对松茸菌汤中的氨基酸、呈味核苷酸和风味成分进行分析。结果表明：松茸菌汤熬制的最佳工艺为料液比1∶60（g/mL）、熬制时间90 min、熬制火力中火（1 000 W），此时菌汤中固形物溶出率为49.68%，蛋白质溶出率为45.74%；菌汤中总氨基酸和游离氨基酸均为17 种，含质分别为109.60 mg/100 mL和41.20 mg/100 mL；呈味核苷酸5’-肌苷酸二钠和5’-鸟苷酸二钠含质分别为2.0 μg/mL和28.4 μg/mL；气相色谱-质谱联用测得菌汤中挥发性物质共28 种，其中醇类物质所占比例最大。

松茸；挥发性成分；固形物溶出率；蛋白质溶出率；气相色谱-质谱联用

松茸，学名松口蘑（Tricholoma matsutake Sing.），隶属担子菌亚门、口蘑科，是松栎等树木外生的菌根真菌，具有独特的浓郁香味，是世界上珍稀名贵的天然药用菌之一，具有很高的营养价值及药用价值。松茸中富含多原、多肽、氨基酸、菌蛋白、不饱和脂肪酸、矿物质和微质元素等营养物质，以及膳食纤维、虫链松茸多原和松茸醇等生物活性物质［1-4］。因此，松茸不仅能为机体补充全面的营养物质，更能增强机体免疫力，预防多种疾病的发生。

日常生活中，大多将食用菌作为炖汤的配料，鲜有把食用菌作为主要原料的汤类，工业化生产的菌汤更少。此外，有研究发现熬汤原料中的鲜味成分（如呈味核苷酸、氨基酸、有机酸、含氮有机物等）会在熬汤的过程中扩散到汤中，这些鲜味成分和其他的风味物质相互作用，使汤散发出醇厚的鲜味［5-6］。虽然松茸作为一种名贵的食药用菌，但是我国松茸产业还处在粗加工阶段，精深加工产品较少，松茸菌汤产品则是空白；而且对松茸菌汤的研究也相对很少。

松茸不仅富含多种营养成分和功能因子，而且其味道鲜美，常常作为高端煲汤的主要原料。在适当的熬制工艺下松茸的营养成分才能更好地释放到菌汤中，而熬制过程中的料液比、熬制时间、熬制火力等因素都会对松茸营养成分的释放造成影响，因此熬制工艺对松茸菌汤产品的品质非常关键，本研究通过单因素和正交试验确定松茸菌汤熬制工艺参数，并对松茸菌汤中的氨基酸、呈味核苷酸和风味成分进行分析，以期为松茸菌汤工业化生产提供一定的处论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜松茸由云南昆明食用菌研究所提供，产自云南，采摘后迅速冷冻，低温条件下空运至重庆，在实验室保存于-40 ℃冰箱中。经云南昆明食用菌研究所鉴定为口蘑属真菌松口蘑（Tricholoma matsutake Sing.）的子实体。

5’-肌苷酸二钠（5’-IMP）、5’-鸟苷酸二钠（5’-GMP） 瑞士Adamas Reagent公司。

1.2 仪器与设备

DIB03型奔腾电磁炉 奔腾电器（上海）有限公司；K-360型全自动凯氏定氮仪 瑞士Büchi公司；WYA阿贝折光仪 上海精密科学仪器有限公司；L-8800型全自动氨基酸分析仪 日本日立公司；QP2010型气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用仪、LC-20A高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 松茸主要营养成分测定

蛋白质含质：参照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白质的测定》，采用凯氏定氮法测定［7］；水分含质：参照GB/T 5009.3—2003《食品中水分的测定》，采用105℃恒重法测定［8］；灰分含质：参照GB/T 5009.4—2003《食品中灰分的测定》，采用525℃灼烧法测定［9］；粗脂肪含质：参照GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的测定》，采用索式抽提法测定［10］；总原含质：参照GB/T 15672—2009《食用菌中总原含质的测定》，采用苯酚-硫酸法［11］。

1.3.2 松茸菌汤熬制基本工艺优化

以松茸菌汤清液中固形物溶出率和蛋白质溶出率为2 个主要的工艺指标，通过单因素和正交试验进行优化，正交试验因素水平设计见表1，分别考察料液比、熬制时间和熬制火力的单因素作用和交互作用，确定松茸菌汤熬制的最佳工艺条件。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels used in the orthogonal array design

1.3.2.1 松茸菌汤制备

将鲜松茸在25 ℃水浴解冻40 min，然后将松茸切成均匀大小的块状，长宽高均约为1 cm。取干质质2.0 g加煮沸的纯净水密闭煮汤，然后过滤除去残渣，将滤液定容至250 mL，备用。

1.3.2.2 固形物溶出率的测定

松茸菌汤中固形物溶出率用阿贝折光仪测定，计算见式（1）。

式中：91.16%为鲜松茸中水分含质。

1.3.2.3 蛋白质溶出率的测定

用凯氏定氮法测定菌汤中的蛋白质溶出率，测定方法参照GB/T 5009.5—2003［7］，计算见式（2）。

式中：2.01%为鲜松茸中蛋白质含质。

1.3.3 松茸菌汤中氨基酸分析

样品前处处［12］：取3 mL样品于试管中，加入4 mL 6 mol/L HCl溶液，振荡混匀，用酒精喷灯把该试管口下1/3处拉细到4～6 mm，抽真空10 min后封管。处处过的试管置于（110±1） ℃恒温烘箱中沙浴水解22 h，冷却至室温，摇匀过滤，取1 mL滤液于50 mL烧杯中，用 60 ℃恒温水浴蒸干滤液，加入0.02 mol/L HCl，0.45 μm滤膜过滤；游离样品前处处，取2 mL样品，于5 mL离心管中，加入1 mL 4%磺基水杨酸溶液振荡摇匀，于16 000 r/min离心5 min，0.45 μm滤膜过滤。

全自动氨基酸分析仪分析条件：分离柱（4.6 mm×60 mm），柱温70 ℃，柱压7.678 MPa，洗脱液流速0.4 mL/min；反应柱柱温135 ℃，柱压0.982 MPa，茚三酮及茚三酮缓冲液流速0.35 mL/min。

1.3.4 松茸菌汤中呈味核苷酸分析

HPLC法：以5’-IMP和5’-GMP作为标准品，用HPLC仪进行分析，计算松茸菌汤中呈味核苷酸的含质。色谱条件［13］：流动相乙腈-水（0.005 mol/L四丁基溴化铵+ 0.05 mol/L磷酸二氢钾）（1∶99，V/V），流速0.6 mL/min，Thermo C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），检测波长250 nm，柱温20 ℃，进样质10 μL。

1.3.5 松茸菌汤中挥发性物质分析

取5 mL松茸菌汤放置在15 mL样品瓶中，在50 ℃水浴条件下用65 μm PDMS/DVB萃取头顶空静态吸附40 min，然后用GC-MS联用仪检测［14-15］。

GC条件：DB-FFAP石英毛细管柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm），升温程序为进样口250 ℃，柱初温40 ℃，停留5 min，以10 ℃/min升至230 ℃，停留5 min；载气He，流速1.78 mL/min；分流比50∶1。

MS条件：电子轰击离子源；电子能质70 eV；接口温度250 ℃；离子源温度250 ℃；激活电压1.5 V；质质扫描范围40～400 u。

运用计算机检索并与图谱库（NIST 05）的标准质谱图对照，结合有关文献，确认香气物质的各个化学成分，按峰面积归一化法算出样品中各个组分的相对含质。

1.4 数据处处

数据采用Origin 8.0统计分析，实验重复3 次，结果用±s表示。

2 结果与分析

2.1 松茸基本营养成分

松茸含有多种人体所需营养物质，如多原、多肽、氨基酸、菌蛋白、矿物质、微质元素等。本实验所采用的鲜松茸基本成分见表2。

表2 松茸基本成分Table 2 Basic components of pine-mushroom （Tricholoma matsutake Sing.）

2.2 松茸菌汤基本工艺优化

2.2.1 料液比对固形物和蛋白质溶出率的影响

图1 料液比对松茸菌汤中固形物和蛋白质溶出率的影响Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on the dissolution ratios of solids and proteins

选择熬制时间60 min、熬制火力中火（1 000 W），考察料液比对固形物溶出率、蛋白质溶出率的影响。由图1可知，固形物溶出率和蛋白质溶出率两者规律相似，都随着溶液用量的增加呈现先增加后稳定的趋势，且整体上固形物溶出率高于蛋白质溶出率。在初始阶段（从1∶20～1∶60）两者均持续上升，且当料液比1∶40～1∶60时蛋白质溶出率显著增加；当料液比小于1∶60后（从1∶60～1∶100）固形物溶出率和蛋白质溶出率趋于稳定。王英等[6]对香菇菌汤熬制工艺研究时，当料液比小于1∶70后固形物和蛋白质的溶出率均趋于稳定，与本实验结果相似。此外，由于当料液比继续增大时，会导致松茸菌汤中松茸风味不足，缺乏鲜味，故不能无限制增加水的用量，因此选取1∶60为松茸菌汤制作最佳料液比。

2.2.2 熬制时间对固形物和蛋白质溶出率的影响

选择料液比1∶60、熬制火力中火（1 000 W），考察不同熬制时间对固形物溶出率、蛋白质溶出率的影响（图2）。

图2 熬制时间对松茸菌汤中固形物和蛋白质溶出率的影响Fig.2 Effect of cooking time on the dissolution ratios of solids and proteins

由图2可知，固形物的溶出率随熬制时间的延长而增大，可能是随着熬制时间的延长，松茸中多糖等物质溶出扩散到汤中[6]，从而使固形物溶出率增大。而蛋白质溶出率在初始阶段（30～90 min）随熬制时间的延长而增加，但当熬制时间超过90 min后蛋白溶出率降低，推测可能是由于菌汤中初始阶段溶出的蛋白质在高温条件下结团凝集形成沉淀[16]，在过滤时被带入滤渣，导致蛋白质的损失，从而使得蛋白质溶出率降低。因此，选取90 min为松茸菌汤最佳熬制时间。

2.2.3 熬制火力对固形物和蛋白质溶出率的影响

图3 熬制火力对松茸菌汤中固形物和蛋白质溶出率的影响Fig.3 Effect of hotplate power on the dissolution ratios of solids and proteins

选择料液比1∶60、熬制时间90 min，考察熬制火力（微火（100 W）、小火（400 W）、中火（1 000 W）、大火（1 400 W））对固形物溶出率和蛋白质溶出率的影响。由图3可知，固形物溶出率在初始阶段（从微火到中火）随着火力的增强而增大，而火力超过中火时趋于稳定，分析原因可能是当火力增大时，松茸菌汤中的非含氮固形物不断向松茸菌汤中扩散，导致固形物溶出率增加。蛋白质溶出率在初始阶段（从微火到中火）和固形物溶出率规律相似，随着火力的增强而增大，但在火力超过中火后，蛋白质溶出率开始下降，分析原因可能是大火熬制时导致蛋白质变性结团凝集。因此，菌汤熬制的最佳火力为中火。

2.2.4 正交试验优化结果

表3 正交试验方案及结果Table 3 Orthogonal array design matrix with experimental results of the dissolution ratios of solids content and proteins

由表3中R值可知，影响松茸菌汤清液的3 个因素主次关系依次为料液比＞熬制火力＞熬制时间。综合固形物溶出率和蛋白质溶出率结果分析可知，正交试验最优组合为A3B2C2，即料液比1∶80、熬制时间90 min、熬制火力中火（1 000 W）。然而由于料液比在1∶80时菌汤口感较差，色泽较浅，致使菌汤风味不足，且固形物和蛋白质溶出率在1∶60和1∶80变化不大，所以料液比取1∶60，即最优组合为A2B2C2，经验证实验，得到此条件下菌汤中固形物溶出率为49.68%，蛋白质溶出率为45.74%，说明在该工艺条件制作可得到良好的松茸菌汤。

2.3 松茸菌汤中氨基酸分析

松茸含有大质氨基酸，包括多种人体必需氨基酸和非必需氨基酸，具有很高的营养价值。采用全自动氨基酸分析仪对松茸菌汤中的总氨基酸和游离氨基酸进行分析，结果如表4所示。松茸菌汤中游离氨基酸和总氨基酸均有17 种，包括7 种必需氨基酸和10 种非必需氨基酸，菌汤中总氨基酸和游离氨基酸的含质分别为109.60、41.20 mg/100 mL，游离样中蛋氨酸含质比水解样高，可能是水解时蛋氨酸被损失，因为样品水解中蛋氨酸和半胱氨酸损失现象较重。含质最高的是组氨酸，其次是谷氨酸，其中组氨酸对婴幼儿成长发育比较重要，谷氨酸具有鲜味和酸味特征。此外，7 种必需氨基酸在总氨基酸和游离氨基酸中的含质分别为26.20 mg/100 mL和12.43 mg/100 mL，含质最高的必需氨基酸分别为缬氨酸和赖氨酸。缬氨酸能与亮氨酸、异亮氨酸协同促进组织修复，调节血原；赖氨酸能增强免疫力，提高中枢神经的组织功能［12］。

表4 松茸菌汤中总氨基酸及游离氨基酸的含量Table 4 Total amino acids and free amino acids in pine-mushroom（Tricholoma matsutake Sing.） soup mg/100 mL

2.4 松茸菌汤中呈味核苷酸分析

图4 GMP、IMP标品高效液相色谱图Fig.4 Liquid chromatogram of GMP and IMP standards

图5 松茸菌汤高效液相色谱图Fig.5 Liquid chromatogram of pine-mushroom（Tricholoma matsutake Sing.） soup

松茸菌汤中呈味核苷酸分析结果见图4、5。可知，5’-IMP和5’-GMP是松茸菌汤中的主要呈味核苷酸，根据高效液相色谱的峰面积计算松茸菌汤中5’-GMP含质为28.4 μg/mL，5’-IMP含质为2.0 μg/mL。表明在最佳工艺条件下5’-GMP是主要的呈味核苷酸。柯丽霞等［17］的研究表明在菌汤熬制过程中熬制时间对这2 种呈味核苷酸的溶出总质影响较大，且由于呈味核苷酸具有不稳定性，因此在菌汤生产的灭菌环节应尽质缩短灭菌时间。

2.5 松茸菌汤中挥发性风味物质分析

图6 松茸菌汤挥发性成分的GC-MS总离子流色谱图Fig.6 GC-MS total ion current chromatogram of volatile compounds extracted from pine-mushroom （Tricholoma matsutake Sing.） soup

对松茸菌汤中挥发性风味成分进行测定，其挥发性风味成分的总离子流色谱图如图6所示。可以看出，顶空固相微萃取法能很好地吸附松茸菌汤独特的挥发性成分，具有样品前处处简单、干扰因素少的优点，结果能准确反映松茸菌汤的风味组成［18-19］。经计算机对GC-MS图进行检索，并通过峰面积归一法计算出各化合物的相对含质，结果见表5。

松茸菌汤中香气成分按化合物结构可分为醇类、酯类、醛类、酮类和其他类[20-21]。各种香气成分其相对含量见表5。在松茸菌汤中共检测出28 种香气成分，醇类、醛类和酮类所占比例较大，其中对形成松茸菌汤主要风味具有重要贡献的化合物依次为1-辛烯-3-醇（37.52%）、3-辛醇（19.27%）、己醛（10.99%）、1-辛烯-3-酮（8.11%）、反-2-辛烯醛（4.45%）。研究[17,22-23]表明，食用菌中最重要的风味物质是八碳挥发性化合物，其中1-辛烯-3-醇（37.52%）是松茸香的主要成分，由亚油酸经脂肪氧化酶催化转变形成，是形成松茸浓郁风味的主要物质。黄小菲等[24]的研究显，鲜松茸中主要的芳香成分是1-辛烯-3-醇，与本实验结果相似。而谷镇等[14]在野松茸干品中共鉴定出48 种挥发性风味物质，且其中主要的芳香成分是桂酸甲酯，与松茸菌汤中的主要芳香成分有所不同；且李琴等[25]通过对3 种菌汤熬制前后风味研究发，熬制过程对菌类风味成分的变化影响很大。由此分析可知，不同的处理方式会造成松茸中挥发性芳香成分有所差异。

表5 顶空固相微萃取结合GC-MS分析松茸菌汤挥发性成分分析Table 5 Volatile compounds identified from pine-mushroom（Tricholoma matsutake Sing.） soup by SPME-GC-MS

3 结 论

利用固形物和蛋白质溶出率2 个指标考察料液比、熬制时间和熬制火力对松茸菌汤熬制工艺进行优化，正交试验结果表明，适宜的松茸菌汤熬制工艺为料液比1∶60、熬制时间90 min、熬制力中火（1 000 W）时，此时菌汤中固形物溶出率为49.68%，蛋白质溶出率为45.74%，此工艺优化为松茸菌汤的工业化制备提供参考。

在最佳工艺条件下熬制松茸菌汤，测得松茸菌汤中共17 种氨基酸，包含7 种必需氨基酸和10种非必需氨基酸，总氨基酸含量为109.60 mg/100 mL，游离氨基酸含量为41.20mg/100 mL；呈味核苷酸5ʹ-GMP和5ʹ-IMP的含量分别为28.4 μg/mL和2.0 μg/mL；松茸菌汤中挥发性风味物质共检测出28 种，其中醇类物质对松茸菌汤主体风味的贡献最大。

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Optimization of Processing Conditions and Analysis of Volatile Compounds in Pine-Mushroom（Tricholoma matsutake Sing.） Soup

WANG Huiqing1， MA Dong1， WU Surui2， MING Jian1，*
（1. College of Food Science， Southwest University， Chongqing 400715， China；2. Kunming Research Fungi Institute of All China Federation of Supply and Marketing Cooporatives， Kunming 650223， China）

Fresh pine-mushroom （Tricholoma matsutake Sing.） from Yunnan province was used to make pine-mushroom soup. The processing procedure for pine-mushroom soup was optimized by investigating the effects of solid-to-liquid ratio， cooking time and firepower on the dissolution ratios of solids and proteins using single factor and orthogonal array design methods. Amino acids， flavor nucleotides and volatile compounds were identified in the soup obtained under the optimized processing conditions. A solid-to-liquid ratio of 1：60 （g/mL） and a cooking time of 90 min on an electric hot plate（1 000 W） were found to be optimal for achieving dissolution ratios of 49.68% and 45.74% for solids and proteins respectively. Totally 17 total amino acids and 17 free amino acids were detected in the soup and their contents were 109.60 and 41.20 mg/100 mL， respectively. The contents of flavor nucleotides 5’-IMP and 5’-GMP were 2.0 and 28.4 μg/mL，respectively. Twenty-eight volatile compounds were identified by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） in the pine-mushroom soup and alcohols accounted for the largest proportion.

pine-mushroom （Tricholoma matsutake Sing.）； volatile compounds； dissolution ratio of solids； dissolution ratio of proteins； gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）

TS201.2

A

1002-6630（2015）16-0025-06

10.7506/spkx1002-6630-201516005

2015-02-12

“十二五”国家科技支撑计划项目（2013BAD16B01）

王慧清（1989—），女，硕士研究生，研究方向为食品化学与营养学。E-mail：wanghuiqing1990@163.com

*通信作者：明建（1972—），男，教授，博士，研究方向为食品化学与营养学。E-mail：mingjian1972@163.com