香水梨果实多酚氧化酶动力学研究及其底物对组织褐变的影响

贝盏临，张欣，雷茜，张安东

（北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏银川750021）

香水梨果实多酚氧化酶动力学研究及其底物对组织褐变的影响

贝盏临，张欣，雷茜，张安东

（北方民族大学生物科学与工程学院，宁夏银川750021）

以宁夏海原香水梨为试材，采用分光光度法对香水梨多酚氧化酶（PPO）及不同抑制剂的动力学特征及其底物对组织褐变的影响进行了研究。实验表明：香水梨PPO活性是随时间变化逐渐增加，正好与香水梨出现褐变的时间吻合；将邻苯二酚和焦性没食子酸两种底物与香水梨PPO作用后进行全波段（200 nm～650 nm）扫描，274、275 nm处有吸收峰，可推断香水梨PPO作用邻位二元酚和三元酚能力很强；以邻苯二酚为底物，测定不同抑制剂对香水梨PPO活力的影响，抑制效果依次为抗坏血酸>间苯二酚>L-半胱氨酸>EDTA。

香水梨；多酚氧化酶；活性；底物专一性；抑制效应

香水梨（Pgrus ussuriensismaxim），又名软儿梨、化心梨、消梨、老香水，属波斯梨科果实，是梨中独一种。香水梨黄河沿岸普遍栽植，入秋成色清黄鲜亮，果味微酸，熟后摘下冻藏，肉质变成褐色，解冻后汁液较多，营养丰富，食如甘蜜，可润肺止咳、清胃泻火，亦能醒酒，是馈赠亲友的珍品。宁夏海原县种植香水梨的历史近百年，尤其是关桥乡、史店乡等地产出的香水梨色、香、味独特，清凉爽口，深得区内外各地客商的青睐，每到收获季节，南来北往的商贩纷至沓来。香水梨在宁夏海原地区种植面积广，产量大，是鲜食和罐头加工的主要品种之一，但由于褐变作用导致梨的颜色变深[1]，从而大大降低了产品的实际应用价值，是长期以来需要解决的一个问题。本实验研究了香水梨果实多酚氧化酶的作用条件以及抑制剂对该酶的抑制效果，可为提高香水梨加工、贮藏过程中的感官质量，提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

香水梨于2012年9月底采自宁夏海原县关桥乡，经过后熟软化后置于-20℃冰箱冻藏。

1.1.2 实验药品

磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、邻苯二酚、焦性没食子酸、间苯二酚、L-酪氨酸、乙二胺四乙酸、抗坏血酸，药品均为分析纯。

1.1.3 实验器材

FA2104B电子天平、UV765紫外-可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；ALPHA 1-2冷冻干燥机：德国Marin Christ公司；Sigma4K15离心机：德国Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 多酚氧化酶的活性测定

取保存在冰箱的香水梨，去皮后称取20 g果肉，加入10mL 0.1mol/LpH 6.0的冷磷酸缓冲溶液，用研钵研碎成浆，此过程不少于5min，用pH 6.0的冷磷酸缓冲溶液定容到100mL，4℃下浸提10min，4层纱布粗滤后立即在4℃下8 000 r/min离心10min，离心后取上清液，加入适量活性炭脱色30min，过滤即得PPO提取液[2-3]。香水梨多酚氧化酶提取液保存在冰箱内。

比色皿中加入0.1 mol/L邻苯二酚溶液1 mL，0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液至比色皿3/4处，PPO提取液0.5mL，混匀后在400mm处比色，在PPO提取液加入后开始计时，每30秒记录一次OD随时间的变化值，测3组值，以最初直线段的斜率（△D/t）计算酶活力。一个酶活力单位定义为：在测定条件下，以在1min内引起吸光度增加0.01所需的量为一个酶活性单位（以U/min表示）[4-5]。

1.2.2 多酚氧化酶的底物专一性

以浓度均为0.01mol/L的多酚氧化酶发生反应的底物，分别吸取1mL得邻苯二酚和焦性没食子酸在恒温水浴锅30℃下保温10min，再分别吸取0.1mol/L pH6.0的磷酸缓冲溶5mL和PPO PPO提取液1mL，在恒温水浴锅30℃下反应5min，用UV765紫外-可见分光光度计在200 nm～650 nm扫描[6]。

1.2.3 不同抑制剂对多酚氧化酶活性的影响

以邻苯二酚作底物，测定EDTA、VC、L-半胱氨酸、间苯二酚等4种抑制剂对多酚氧化酶活力的影响[7]。抑制剂与酶不同预结合时间（0～20min）对酶活性的影响，并采用分光光度法测定酶活[8-9]。

2 结果与分析

2.1 多酚氧化酶的活性测定结果分析

香水梨PPO活性随时间的变化见图1。

图1 香水梨PPO活力随时间变化曲线Fig.1 Pgrus ussuriensismaxim PPO activity changes with time

香水梨多酚氧化酶活性是随时间变化逐渐有上升的趋势，最终趋于平缓。多酚氧化酶活性的显著增加正好与香水梨出现褐变的时间相吻合。

2.2 多酚氧化酶与底物作用结果

多酚氧化酶与底物作用结果见图2。

图2 香水梨PPO氧化两种底物所产生的吸收曲线Fig.2 Absorption curve of Pgrus ussuriensismaxim PPO oxidation of two kinds of substrate generated

将香水梨多酚氧化酶与邻苯二酚、焦性没食子酸两种底物作用后的产物在200 nm～650 nm进行扫描，观察到以邻苯二酚、焦性没食子酸反应均有吸收峰出现，分别是274、275 nm。

2.3 不同抑制剂对多酚氧化酶活性的影响

不同抑制剂对多酚氧化酶活性的影响如图3。

图3 不同抑制剂对香水梨PPO活性的影响Fig.3 Effects of different inhibitors on PPO activity of Pgrus ussuriensismaxim

多酚氧化酶活性是酶促褐变的关键制约因素之一[10-11]，EDTA对香水梨中多酚氧化酶的抑制作用不是十分理想，L-半胱氨酸、间苯二酚、抗坏血酸，较EDTA能较好地抑制多酚氧化酶的活性。在同一浓度下，不同抑制剂对多酚氧化酶的抑制效果存在差异，其中抗坏血酸抑制香水梨中多酚氧化酶的活性的效果为最好，其次才是是间苯二酚、L-半胱氨酸、EDTA。

3 结论与讨论

香水梨采后贮藏初期，酚类物质主要是合成过程，香水梨贮藏酚类物质减少是由于多酚氧化酶催化下而被氧化成黑色物质导致褐变所致，说明香水梨的褐变是以酚类物质为作用底物的多酚氧化酶所引起的酶促氧化褐变。

此外，香水梨多酚氧化酶作用邻位二元酚和三元酚能力很强，通常多元酚不能使苯环上引入了某些基团激活苯环，才会出现吸收峰。同一浓度下，抑制香水梨中多酚氧化酶的活性的效果为抗坏血酸>间苯二酚>L-半胱氨酸>EDTA。对于香水梨多酚氧化酶的抑制剂在实际生产中较为理想的是抗坏血酸，它既具有较好的抑制效果，又是食品中固有的营养成分，且安全性高。但是抗坏血酸本身易于被氧化，所以要使其能保持一定的抑制效果就要保持其含量的稳定。在果品加工过程中提倡多种抑制剂结合使用以提高抗褐变效果，因此还需在对香水梨抑制剂单因素研究的基础上，对不同抑制剂多因素协同作用机理和抑制效应做深入综合研究，更好地提高对香水梨多酚氧化酶的活性的抑制效果。

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Effect of Pgrus ussuriensismaxim Polyphenol Oxidase Kinetics and Substrate on Fruit Browning

BEI Zhan-lin，ZHANG Xin，LEI Qian，ZHANG An-dong
（College of Biological Science and Engineering，Beifang University of Nationalities，Yinchuan 750021，Ningxia，China）

In this experiment，Ningxia Haiyuan Pgrus ussuriensis maxim as material，using spectrophotometry to Pgrus ussuriensismaxim polyphenol oxidase （PPO）and different inhibitors and substrates on the dynamic characteristics of Tissue Browning were studied.Experiments showed that Pgrus ussuriensis maxim PPO activity was gradually increased with time change，just browning time consistent with Pgrus ussuriensis maxim appear；the catechol and pyrogallol two substrates and Pgrus ussuriensismaxim after PPO of full band（200 nm-650 nm）scanning，274 nm，275 nm of a peak，Can be inferred Pgrus ussuriensismaxim PPO ortho phenol and three yuan two yuan strong ability to phenol；Catechol as substrate，to determine the effects of different inhibitors on the activity of PPO inhibitory effect of Pgrus ussuriensismaxim，followed by VC>L-cysteine>resorcinol>EDTA.

Pgrus ussuriensismaxim；polyphenol oxidase；activity；substrate specificity；inhibitory effect

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.03.001

2013-12-16

宁夏科技支撑项目（2012）；国家级大学生创新训练计划项目（XJCX-2014-102）

贝盏临（1975—），男（汉），讲师，硕士，主要从事植物资源与利用的科研和教学工作。