病原体逃逸中性粒细胞胞外诱捕网机制

夏 杰， 王 蓉

(黄冈职业技术学院 医药卫生学院，湖北 黄冈 438000)



病原体逃逸中性粒细胞胞外诱捕网机制

夏 杰， 王 蓉

(黄冈职业技术学院 医药卫生学院，湖北 黄冈 438000)

中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)是新发现的中性粒细胞抗病原机制，是天然免疫系统的重要组成部分。但病原体在进化中形成了针对NETs的免疫逃逸机制。不同的病原体逃逸NET的机制不同，本文主要介绍3种机制：降解NETs-DNA、表面分子机制和NETosis调控。

中性粒细胞；中性粒细胞胞外诱捕网；免疫逃逸；病原体

中性粒细胞是人体天然免疫系统抗病原微生物的第一线效应细胞。中性粒细胞通过吞噬作用、脱颗粒作用与形成胞外诱捕网(NETs)参与病原体感染的免疫应答反应[1]。NETs是近年来发现的中性粒细胞新的抗病原体机制。2004年，Brinkmann等[2]发现IL-8或PMA处理过的中性粒细胞在胞外产生一种纤维状结构，进一步研究发现这些纤维状结构由染色质DNA、组蛋白以及颗粒源蛋白构成并且具有抗菌作用。利用透射电子显微镜(TEM)、扫描电子显微镜(SEM)、免疫荧光和活细胞成像技术，Brinkmann等观察到中性粒细胞在IL-8、PMA的刺激作用下，核膜和颗粒膜崩解，染色质DNA、组蛋白以及颗粒源蛋白等成分混合，并随着细胞膜的崩解而释放出来，即NETs。中性粒细胞的这种死亡程序称为NETosis。NETs是中性粒细胞针对病原体的天然免疫反应。NETs结构阻止了病原体扩散，并维持抗菌物质在局部聚集，有利于病原体及其毒力因子的清除和杀灭[3]。NETs对细菌、病毒、真菌等病原体都有不同程度的抗感染作用，而这些病原体也通过不同的策略逃逸NETs的捕获[4]。本文主要讨论病原微生物针对NETs的免疫逃逸机制。

1 降解NETs-DNA

1.1 脱氧核糖核酸酶(DNase)

许多病原菌可以产生DNase，早已证明这种酶利于感染菌的扩散。最近的研究表明DNase与病原微生物逃逸NETs的捕杀有关。A群链球菌(GAS)与许多人类疾病相关。Sumby等[5]对M1血清型 GAS菌株MGAS5005 基因测序，发现了3个编码DNases的基因。进一步通过动物实验发现，这3个基因灭活的突变菌株毒性明显较低，活体内清除速度更快。Buchanan等[6]假设GAS通过DNase降解NETs-DNA逃逸NETs介导的中性粒细胞杀伤作用，他们运用等位基因替代、单基因互补和异源表达等分子遗传学方法，利用坏死性筋膜炎小鼠模型作为感染载体，对能产生DNase的野生型M1血清型GAS菌株和不能产生DNase的同基因型M1ΔSda1突变菌株进行对照试验。实验结果表明，DNase能促进NETs的降解，从而增强GAS在体内的存活能力和毒性；相反，DNase阻断剂G-肌动蛋白(G-actin)可在体外增强中性粒细胞清除GAS，体内降低GAS毒性。所以，表达DNase的GAS能对抗NET介导的杀菌途径。因此，设计消除DNAse活性或维持NETs完整性的药物，可以作为抗菌治疗的辅助治疗药物。

1.2 核酸内切酶A(Endonuclease A, EndA)

肺炎链球菌是社区获得性肺炎最常见的病原体，大量中性粒细胞浸润是其主要特点之一。由于肺炎链球菌表达抗吞噬荚膜，所以在感染早期中性粒细胞吞噬作用起效甚微。已知肺炎链球菌TIGR4(血清型4)endA基因是化脓性链球菌DNase基因spd和sda的同源基因，表达一种膜结合核酸内切酶(EndA)。Beiter等[7]用TIGR4感染PMA处理的中性粒细胞，5 min后观察到TIGR4被NETs捕获，但并没有检测到TIGR4被NETs或吞噬作用杀灭，他们将释放NETs的中性粒细胞分别与牛胰源DNase、TIGR4Δ(endA)(endA敲除突变体)和TIGR4共培养30 min，结果显示，牛胰源DNase或TIGR4能降解NETs，破坏NETs完整性，而TIGR4Δ(endA)不能破坏NETs完整性。因此，EndA具有DNase功能，能破坏NETs的结构。为了证实EndA是否有助于GAS逃逸NETs，Beiter等[7]进一步将PMA处理的中性粒细胞分别感染 TIGR4(血清型4)、TIGR4Δ(endA)(endA敲除突变体)和TIGR4Δ(endA) (endA) (逆转体)3种菌株，30 min后，不能产生EndA的TIGR4Δ(endA)依然被NETs缠绕，而能产生EndA的TIGR4和TIGR4Δ(endA)(endA)逃离NETs，并且NETs被严重破坏。因此，EndA能够有效降解NET-DNA骨架，逃逸NETs的捕杀；将这种核酸内切酶作为靶点是一种有前途的抗菌治疗策略[8]。Beiter等[7]还检测了7种不同荚膜型(血清型1、3、4、7F、14、19F)肺炎链球菌菌株，表明除血清型1菌株外，其他都表现出很强的EndA活性。因此，降解NETs是各型肺炎链球菌逃逸NETs的普遍策略。尽管所有致病肺炎链球菌都被检测出表达EndA并能破坏NETs，但不同类型菌株表达EndA水平不同，相应致病能力也不同。因此，对于这种高度可变菌种而言，不同菌株可能被赋予不同的致侵袭性疾病的风险。

2 病原表面分子机制

2.1 分子模拟

唾液酸(Sias)一般只在多细胞生物细胞表面表达，是一类定位于复合多糖末端的九碳糖酸[9]。人类嗜中性粒细胞 Siglec-9是一种能够识别Sias的凝集素，Siglec-9识别宿主细胞Sias作为“自我”的标志，负性调节中性粒细胞活性[10]。少数细菌也表达Sias，如B群链球菌(GBS)、大肠埃希菌K1(EscherichiacoliK1)、脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)、空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)等[9]。BSAb是一种能阻断Sias与Siglec-9结合的抗Siglec-9IgG单克隆抗体，NBSAb是一种不能阻断Sias与Siglec-9结合的抗Siglec-9IgG单克隆抗体，Carlin等[10]利用这两种抗体作为区分是否阻断Sias结合位点的试剂，研究了GBS与中性粒细胞的相互作用关系。实验显示，存在BSAb情况下，相对于NBSAb，GBS刺激中性粒细胞产生更强的氧爆作用，释放更多的颗粒蛋白酶和产生更多的NETs。因此，GBS可通过Sias或Siglec-9依赖的方式反式作用于中性粒细胞，降低其活性。

虽然没有文献报道铜绿假单胞菌(PA)可以合成Sias，但Khatua等[11]证实PA可以从周围环境中直接吸附Sias，并通过与中性粒细胞siglec-9 的交互作用减少其活性氧族(ROS)和弹性蛋白酶(elastase)的产生，进而弱化ROS和elastase介导的 NETs形成。PA通过这种方式实现了免疫逃逸。在某些病理情况下血清Sias水平显著升高，如风湿性关节炎、骨髓瘤、晚期癌和肺结核等[12]。而这些疾病对PA高度易感，可能与 PA吸附Sias有关。和PA一样，某些革兰阴性菌也可以从周围环境吸附Sias，如嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza)、多杀巴斯德菌(Pasteurellamultocida)和 杜克雷嗜血杆菌(Haemophilusducrey)等[13]。Khatua等[11]认为，吸附Sias可能是那些不能合成Sias病原体实现免疫逃逸的一种普遍性的方式。

2.2 分子限定

烟曲霉菌(A.fumigatus)是一种重要的空气传播致病真菌，致使免疫力低下的患者发生致命感染。分生孢子(conidia)是真菌产生的一种形态较小的无性繁殖体，被吸入呼吸道后遭遇由巨噬细胞和中性粒细胞构成的天然免疫系统。分生孢子主要由巨噬细胞和中性粒细胞杀灭，菌丝由中性粒细胞杀灭[14]。已知疏水蛋白RodA(hydrophobin RodA)是烟曲霉菌表面主要的蛋白质组分， RodA主要表达于休眠分生孢子(resting conidia),在肿胀分生孢子(swollen conidia)上数量减少，菌丝(hyphae)完全缺乏[15]。Aimanianda等[16]证实RodA可以降低天然免疫系统的活性。Bruns等[14]用双光子显微镜技术(two-photon microscopy)适时观察了烟曲霉菌感染小鼠的肺组织，发现中性粒细胞浸润并形成NETs。为了进一步明确RodA与NETs的关系，Bruns等[14]分析了因ΔrodA突变RodA缺陷的休眠和肿胀分生孢子，明确了RodA对NETs形成的影响。结果表明，与野生型相比，中性粒细胞遇到ΔrodA突变肿胀和休眠分生孢子时NETs形成显著增加。其中ΔrodA突变休眠分生孢子诱导NETs形成的作用比任何形式的菌丝还强。将纯化RodA 加入ΔrodA突变分生孢子可减少NETs形成。这表明RodA是抑制中性粒细胞NETs形成的主要因素，同时也提示，休眠体分生孢子本身能强效诱导NETs形成，只是这种作用被RodA所屏蔽。Bruns等[14]推测是RodA隐藏了免疫活性蛋白或胞壁糖等成分，这种推测可以解释为何菌丝比休眠或肿胀分生孢子具有更强的诱导NETs形成的能力。因此, RodA有利于曲霉菌逃逸NETs介导的免疫应答，构成了烟曲霉菌逃逸中性粒细胞的一个分子限定途径。

3 NETs/NETosis调控

Jenne等[17]通过小鼠感染模型实验证明病毒感染可以使中性粒细胞在肝脏脉管系统募集并诱导NETs形成，同时指出NETs在早期抗病毒免疫，限制病毒扩散方面发挥重要作用。然而，很多研究表明在某些炎症性疾病中NETs表现出组织损伤特性，包括某些病毒性肺炎。

猫白血病病毒(Feline leukemia virus ，FeLV)是一种在猫科动物间传播的逆转录病毒，60%的感染动物可建立体液免疫形成高滴度中和抗体，30%不能建立有效体液免疫而发生持久病毒感染，可导致致命的肿瘤，造血系统的退化以及免疫系统缺陷，因此，FeLV感染常被人类用来作为研究HIV的模型[18]。已知FeLV可以降低中性粒细胞的功能。为了明确FeLV对NETs形成的影响，Wardini等[19]对FeLV阴性和FeLV阳性无症状以及 FeLV阳性有症状的3组猫的中性粒细胞进行对照研究。在利士曼原虫前鞭毛体(Leishmaniapromastigotes)的刺激下，FeLV阴性和FeLV阳性无症状猫中性粒细胞NETs形成量显著高于FeLV阳性有症状猫中性粒细胞。然而，在没有利士曼原虫前鞭毛体的刺激时候，情况却完全相反。这些现象表明NETs被FeLV调节；FeLV感染耗竭了NETs抗菌机制，为其他病原体逃逸NET创造了条件。

HIV-1属于慢病毒亚科的一种逆转录病毒，通过感染人CD4+T细胞和巨噬细胞摧毁人的免疫系统，最终发展为AIDS。已知髓过氧化物酶(MPO)和α-防御素(α-defensin)存在于NETs上，可灭活HIV-1[20]。Saitoh等[21]对NETs抗HIV-1反应进行了深入研究。研究显示HIV诱导NETosis，并且通过超分辨率结构照明显微镜(SR-SIM)观察到HIV被NETs捕获。NETs不仅能限制HIV，还能通过MPO和α-防御素降低其感染性。因此，NETs在天然免疫抗HIV中发挥重要作用。然而，HIV可以雇佣某些免疫细胞以促其繁殖，尤其是树突状细胞(dendritic cells，DCs) 。如HIV与DCs特异性细胞间粘附分子DC-SIG N(也称为CD209)结合，促进感染CD4+T 细胞[22]。Saitoh等[21]研究表明，HIV与孤立DCs结合导致一种NETosis抑制因子产生；重组gp120(HIV的一种膜糖蛋白)处理DCs可产生相同效应；抗CD209中和抗体可阻断此效应，深入的分析发现，这种抑制因子是 IL-10。因此，HIV不仅通过DCs的CD209感染CD4+T细胞,也通过依赖gp120-CD209途径下调NETosis，逃避NETs的捕杀。HIV感染个体容易继发肺结核、肺炎链球菌等感染。所以，这些发现在抗艾滋病治疗中如何维持天然免疫功能有重大指导意义。

综上所述，NET是新发现的中性粒细胞抗病原机制。病原体在进化中形成了针对NETs的免疫逃逸现象。这种针对NETs的免疫逃逸现象反过来也证明了NETs在天然免疫中的重要作用。病原体逃逸NETs的原理在临床上已经有所运用，如临床上使用重组脱氧核糖核酸酶(rhDNAse)清除肺囊性纤维化(CF)患者气道内的浓稠黏液，主要成分是NETs，其实是模仿链球菌的策略；对 AIDS而言，如果能消减 IL-10的效应可能有利于降低继发性感染率。然而，针对病原体逃逸NETs机制的临床疗法还有待进一步研究。所以，深入研究病原逃逸NETs的分子机制，为预防和治疗感染性疾病提供新的研究方向和前景。

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Mechanism of Pathogen Escape from Neutrophil Extracellular Traps (NETs)

XIA Jie, WANG Rong

(Med&HealthColl.,HuanggangPolytech.Uni.,Huanggang438000)

Neutrophil extracellular trap (NET) is a new discovered pathogen-resistant mechanism of neutrophil, it is considered to be the important component of the human innate immunity system. However, during the evolution process the pathogens have formed the mechanism of immune escape against NETs. Different pathogens have different NET escaping mechanisms, such as NETs-DNA degradation, surface molecule and modulation of NETosis were briefly introduced in this paper.

neutrophils; neutrophil extracellular traps (NETs); immune escape; pathogen

夏杰 男，主治医师。现从事生物化学与免疫学的教学与研究工作。Tel：0713-8346091，E-mail:1787315922@qq.com

2014-10-30；

2015-04-21

Q939.91;R392.1

A

1005-7021(2015)06-0086-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.06.017