潜阳解毒通络方对自发性高血压大鼠心肌纤维化的影响

崔英子 郭家娟 李相军 魏岩 宋晶

潜阳解毒通络方对自发性高血压大鼠心肌纤维化的影响

崔英子1郭家娟1李相军2魏岩3宋晶3

目的 观察潜阳解毒通络方在自发性高血压大鼠（SHR）心肌组织胶原合成和心肌纤维化中的作用。方法 12周龄雄性自发性高血压大鼠（SHR）分为SHR应用潜阳解毒通络方组（QYTL组）、SHR应用糜酶抑制剂组（Chy-I组）、SHR应用潜阳解毒通络方及糜酶抑制剂组（QY＆ Chy-I组）、SHR组，另设10只12周龄的雄性W istar-Kyo to大鼠（W KY）为正常对照组。检测各组大鼠的收缩压、心肌胶原容积分数（CVF）、心肌血管周围胶原面积比（PVCA）和心肌糜酶及I、III型胶原m RNA表达水平。结果 QYTL组、QY＆ Chy-I组和Chy-I组心脏CVF、PVCA 与SHR组比较显著下降（P＜0.01），与W KY组比较无显著差异。QYTL组、QY＆ Chy-I组和Chy-I组心肌组织I、III型胶原和糜酶m RNA表达相对含量均低于SHR组（P＜0.01），与W KY组比较无显著性差异。QYTL组、QY＆ Chy-I组大鼠血压与SHR比较有显著改变，Chy-I组大鼠血压与SHR比较无显著改变。结论 心肌组织糜酶参与胶原的合成及细胞外基质的形成和降解，潜阳解毒通络方可能通过抑制糜酶途径改善心肌纤维化。

潜阳解毒通络方；糜酶；自发性高血压大鼠；心肌纤维化；胶原

高血压左心室肥厚的发展伴有心肌细胞肥大和心肌间质纤维化。多项研究［1］证实，Chymase在心室肥厚、心肌纤维化、心衰的发生、发展中起重要作用。Chymase已成为心血管疾病的重要药靶，从Chymase-AngⅡ途径探讨心室肥厚及其干预有着重要的理论与临床意义。课题组依据任继学教授提出的“毒伤血络”学说基础，以调整肝肾、化瘀通络为原则组成“潜阳解毒通络”方，临床疗效可靠。前期研究已证实AngII是潜阳解毒通络方改善自发性高血压大鼠（SHR）左室肥厚，逆转心肌间质重构的重要靶点。本研究通过观察潜阳解毒通络方对心肌肥厚、心肌胶原合成和心肌纤维化相关指标的影响，探讨潜阳解毒通络方介导Chymase·AngⅡ途径干预心室肥厚机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及分组 12周龄雄性自发性高血压大鼠（SHR）40只适应性喂养1周后，按随机数字表法分为潜阳解毒通络治疗组、糜酶抑制剂组、潜阳解毒通络+糜酶抑制剂组、SHR空白对照组，每组各10只；另设10只12周龄的雄性Wistar-Kyoto大鼠（WKY）为正常对照组。均由北京维通利华公司提供。均予喂养普通饲料，并灌胃等量正常饮用水。

1.1.2 实验药物 （1）潜阳解毒通络方（主要成分：夏枯草、牛膝、茺蔚子等）由吉林万通医药有限公司生产，每克清膏含生药10.625 g。（2）糜酶抑制剂SBTI（Soybean trypsin inhibitor），购于Sigma公司。

1.1.3 给药 （1）潜阳解毒通络治疗组：给予灌胃潜阳解毒通络方混悬液15 m l·kg-1·d-1，2次/天；（2）糜酶抑制剂组：给予糜酶抑制剂10mg/（kg·d）；（3）潜阳解毒通络+糜酶抑制剂组：给予糜酶抑制剂10mg/（kg·d），给予灌胃潜阳解毒通络方混悬液15m l·kg-1·d-1，2次/天；（4）SHR空白对照组：予等量生理盐水灌胃；（5）WKY正常对照组：予等量生理盐水灌胃。

1.2 标本采集及实验方法

应用RBP-1B型大鼠尾压测定仪，每周测收缩压（SBP）一次。各组大鼠饲养8周后，戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔麻醉处死，冰上分离左心室，取中间段1/3左心室中性甲醛固定后石蜡包埋切片，其余组织液氮速冻，保存待用。采用改良Masson三色法显示心肌间质纤维，利用计算机真彩色图像分析仪测算心肌间质胶原容积分数（CVF）和心肌血管周围胶原面积比（PVCA）。计算公式：CVF=胶原面/总面积，PVCA=壁内小动脉管腔周围胶原面积/动脉管腔面积。

1.3 心肌组织I、III型胶原和糜酶mRNA表达

采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法进行检测。利用Primers软件设计引物（表1），上海博亚生物技术有限公司合成。

扩增条件：94℃，变性5 min，然后再94℃变性1 min，退火30 s（见表1），72℃延伸30 s，共35个循环；72℃延伸10 min。扩增长度见表1。PCR产物行1.5％琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统（UV Transilluminator）进行图像分析并测其密度比值。

表1 心肌组织I、III型胶原和糜酶引物序列、长度和退火温度

表2 各组动物血压变化［n=9,（x-±s），mm Hg］

表3 各组动物CVF和PVCA的改变［n=9,（x-±s）］

表4 各组动物心肌组织Ⅰ、Ⅲ型胶原和糜酶m RNA表达丰度的变化［n=9,（x-±s）］

1.4 统计分析

采用SPSS 10.0统计学软件进行分析，计量资料以（x-±s）表示，组间比较采用方差分析及LSD-t检验、秩和检验。

2 结果

2.1 各组大鼠SBP水平变化

入组时SHR各组血压均比WKY组显著增高（P＜0.01），实验第2、4、6、8周，QYTL组和QY＆Chy-I组SBP均有不同程度下降，与SHR组比较差异显著（P＜0.01），Chy-I组血压与SHR组SBP比较无显著差异，见表2。

2.2 CVF和PVCA的改变

Masson染色显示，SHR组的心肌细胞和小血管周围胶原纤维环绕呈网格状，血管周围的胶原纤维延伸至心肌细胞间。QYTL组、QY＆ Chy-I组和Chy-I组胶原纤维明显比SHR组减少，见表3。

2.3 心肌组织糜酶mRNA表达改变

QYTL组、QY＆ Chy-I组和Chy-I组心肌组织糜酶mRNA表达丰度比SHR组减少（P＜0.01），与WKY组比较无显著差异，见表4。

2.4 心肌组织I、III型胶原mRNA表达的变化

QYTL组、QY＆ Chy-I组和Chy-I组心肌组织I、III型胶原mRNA表达丰度均比SHR组显著减少（P＜0.01），与WKY组比较无显著差异，见表4。

3 讨论

原发性高血压病（EH）为心血管系统常见病和多发病，其中心肌细胞肥厚和心肌间质纤维化是继发于高血压病的病理过程［2］，严重影响到心血管病人的生存率和生活质量。目前研究认为，肾素血管紧张素系统（RAS）在调节容量超负荷或压力超负荷导致的心肌肥厚和心肌纤维化中起重要作用［3］；其中血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是目前最强的促心肌肥厚因子［4-5］。

近年来的研究显示，机体内存在着两类AngⅡ生成途径：血管紧张素转换酶（angiotensin covertingenzyme，ACE）依赖的AngⅡ生成途径（常规途径）和非血管紧张素转换酶依赖的AngⅡ生成途径（其他途径）。其他途径包括糜酶、血管舒缓素，组织蛋白酶G等。其中糜酶途径是最为重要的途径，研究表明，人体心脏80％的AngⅡ，是通过糜酶（Chymase）产生，来源于心脏组织肥大细胞的糜酶在心脏重构过程中起重要作用，被证实与人体内的多种疾病过程有关，如动脉硬化、高脂血症、动脉瘤等［4，6］。因此糜酶在心血管疾病中的病理生理作用越来越受到重视。本研究结果提示潜阳解毒通络方可能通过抑制糜酶途径发挥了抗心肌纤维化的作用。

由于糜酶抑制剂对血管紧张素I没有影响，因此糜酶抑制剂对于SHR血压未产生影响。而潜阳解毒通络组和潜阳解毒通络方联合糜酶抑制剂组的大鼠血压较SHR空白对照组则有不同程度下降，据此推测潜阳解毒通络方除了通过调整肾素血管紧张素系统（RAS）发挥抗心肌肥厚和心肌纤维化的作用，还可能通过调节糜酶途径发挥了抗心肌纤维化的作用。

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angiotensin system in cardiac tissues of cats w ith pressure-overload cardiac hypertrophy［J］.Am J Vet Res，2008，69（3）：343，348.

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Qianyang Jiedu Tongluo Decoction on the Role of Myocardial Fibrosis Mechanism in Spontaneously Hypertensive Rats

CUI Yingzi1GUO Jiajuan1LI Xiang jun2WEI Yan3SONG Jing3, 1 the Hospital Affiliated to Changchun University of Traditional Chinese M edicine, Changchun 130021, China, 2 Pharmacy Co llege of Jilin University, Changchun 130021, China, 3 Changchun University of Traditional Chinese Medicine, Changchun 130117, China

ObjectiveResearch of Qianyang Jiedu Tongluo（QYTL） decoction inhibition o f M yocardial tissue co llagen synthesis and m yocardial fibrosis to exp lore its mechanism in spontaneously hypertensive rats.MethodsThrough using the method of pathology, com pu ter analysis and reverse transcrip tion po lym erase chain reaction, the spontaneously hypertensive rats divided into QYTL group, Chy-I group, the QY＆ Chy-I group, SHR group, WKY group.Testing the systolic pressure, CVF, PVCA, the myocardial chym ase and co llagen I and III m RNA exp ression.ResultsCom pared w ith the WKY group, CVF and PVCA m RNA exp ression w as significantly inhibited（P＜0.01） in QYTL group, Chy-I group, the QY＆ Chy-I group.Com pared w ith the SHR group, the myocardial chym ase and collagen I and III m RNA expression w as significantly inhibited（P＜0.01） in QYTL group, Chy-I group, the QY＆ Chy-I group.Com pared w ith the SHR group, the systo lic p ressure w as significan tly inhibited（P＜0.01） in QYTL group and the QY＆ Chy-I group.ConclusionThe m yocardial chym ase invo lved in the synthesis of collagen, the formation and degradation of ECM, and p rom ote m yocardial fibrosis in spontaneously hypertensive rats, w hile QYTL could Inhibition myocardial fibrosis through the w ay of Inhibiting the myocardial chymase.

Qianyang Jiedu Tong luo decoction, M yocardial chym ase, Spontaneously hypertensive rats, M yocardial fibrosis, Collagen

R 242

B

1674-9308（2015）28-0178-03

10.3969/j.issn.1674-9308.2015.28.131

1 130021 吉林省长春市长春中医药大学附属医院；2 130021吉林大学药学院；3 130117 吉林省长春市长春中医药大学

教育部科学技术研究重点项目（211041）

郭家娟，E-mail：gjj-2005@163.com