超高效液相色谱-串联质谱法快速测定浓缩果汁中噻菌灵和多菌灵的残留量

郑香平 ， 丁立平， 陈志涛， 郭 菁， 张 睿， 吴文凡

（福清出入境检验检疫局，福建 福清350300）

噻菌灵和多菌灵属于苯并咪唑类杀菌剂，是高效、低毒和广谱的内吸性杀菌剂，被广泛用于水果、蔬菜的病虫害防治［1］。这两种农药虽对农作物起到了良好的保护和治疗作用，但若残留过多会对食用者产生危害。中国、欧盟、美国、日本等国家和地区均对这些农药制定了严格的残留限量标准［2］。近年来，虽然检验检疫部门严格监控农产品中这两种农药的残留，但每年仍有关于这两种农药超标的预警通报。我国是农产品出口大国，水果蔬菜中关于这两种农药残留检测的工作繁重，但同时检测这两种农药的简易方法较少。为了缩短检测周期，提高检测效率，建立快速有效的农药残留的分析方法是十分必要的。

目前有关这两种农药残留分析的方法较多，其中使用较多的方法有液相色谱（LC）法［3-8］以及液相色谱-质谱（LC-MS）法［9-13］等。LC 法的选择性差、灵敏度低；LC-MS 法的选择性和灵敏度高，但前处理方法仍需要液液萃取、固相萃取等复杂的前处理过程以降低基质效应。

本研究探索建立了浓缩果汁中噻菌灵和多菌灵残留的快速检测法，将浓缩果汁样品的pH 值调节至8.0，用乙酸乙酯恒温振荡提取、离心、过滤后，以电喷雾电离串联质谱正离子多反应监测（MRM）模式进行测定。实现了对目标物快速、简单、廉价、高效、耐用、安全分析。此外，本研究对噻菌灵和多菌灵检测过程中存在的基质效应进行了考察。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters Quattro Premier 超高效液相色谱-串联四极杆质谱仪，配备自动进样器、质谱和化学工作站（美国Waters 公司）；IKA T-25 高速分散器（德国IKA 公司）；TurboVap LV 氮气浓缩装置（瑞典Biotage 公司）；3K-15 冷冻离心机（德国Sigma 公司）；BP211D 型分析天平（十万分之一，北京赛多利斯公司）。

甲醇、乙腈为色谱纯（德国默克公司）；乙酸乙酯、氯化钠、氨水为分析纯（国药集团）；噻菌灵（纯度99.0%）和多菌灵（纯度99.0%）标准品（德国Dr. Ehrenstorfer 公司）。

1.2 供试样品

浓缩苹果汁、桃汁、橙汁、梨汁、葡萄汁样品均购自当地市场。供试样品先按照行业标准［14］用水按一定比例稀释后，经过调pH、离心、过滤，用混合相固相萃取小柱进行提取、净化，用配有二极管阵列检测器的液相色谱仪检测，外标法定量，确定为空白样品。保存在4 ℃冰箱中备用。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

称取5.0 g（精确至0.01 g）样品于50 mL 具塞离心管中，用氨水（氨水∶水＝1 ∶1，体积比）调节pH值为8.0，加入25 mL 乙酸乙酯，恒温振荡30 min。提取液中加入氯化钠，使提取液至过饱和，振荡静置分层，以4 000 r／min 转速离心5 min，取上层液5.0 mL 至10 mL 离心管中，氮吹至干，准确移取1.00 mL 水-甲醇-乙腈（体积比为45 ∶45 ∶10）定容。过0.22 μm 滤膜，按仪器工作条件进行测定。

1.3.2 超高效液相色谱-质谱条件

ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），流动相A 为5 mmol／L 乙酸铵-0.1% （体积分数）甲酸水溶液，流动相B 为甲醇。流量0.3 mL／min，梯度洗脱：0 ～2 min，10% B ～90% B；2 ～3 min，保持90% B；3 ～4 min，90% B ～10% B。柱温30 ℃，进样量10 μL。

电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压0.5 kV，锥孔电压25 V，二级锥孔电压3 V，透镜电压0.5 V；源温度120 ℃；脱溶剂气温度350 ℃；锥孔气流量50 L／h，脱溶剂气流量400 L／h；光电倍增管电压650 V，驻留时间0.05 s。MRM 扫描方式。

1.3.3 工作曲线绘制

分别精确称取多菌灵和噻菌灵标准品（精确至0.1 mg），以甲醇溶解并定容至50.0 mL，配成单标准母液。用水-甲醇-乙腈（体积比为45 ∶45 ∶10）稀释至50 μg／L 混合标准溶液。再分别用水-甲醇-乙腈（体积比为45 ∶45 ∶10）和空白样品提取液逐级稀释，配制0.5、1、2、5、10 μg／L质量浓度的标准工作液和相应的基质匹配标准溶液。

1.3.4 添加回收试验

按照1.3.1 节条件称取空白样品并加入适量稀释的噻菌灵和多菌灵标准溶液，混匀后静置2 h，制得加标样品。并按照1.3.1 节和1.3.2 节进行前处理和分析测试。对制得的0.5、1、5 μg／kg 的3 个水平的加标样品进行测定（每个水平重复6 次），计算回收率和相对标准偏差。

1.3.5 基质效应的考察

分别按照1.3.2 节的条件对1.3.3 节得到的标准工作液和相应的基质匹配标准溶液进行测定，以二者斜率的比值η 来判定基质效应的强弱［15，16］。η＞1 表明基质增强，η＜1 表明基质抑制。

1.3.6 实际样品的测定

在市场上随机购买12 份浓缩果汁，其中苹果汁3 份、桃汁2 份、橙汁2 份、梨汁2 份、葡萄汁3 份，按照文献［14］以及1.3.1 节和1.3.2 节进行前处理和分析测试，即12 份样品按照行业标准和本文方法各自检测一次，比较测定结果。

2 结果与讨论

2.1 提取方法的优化

噻菌灵和多菌灵分别在pH 7.2 ～10.9 和pH 7.5 ～11.1 范围内呈中性。果汁样品中含有大量的有机酸，如抗坏血酸和多酚类化合物，为了消除基质干扰，分析前用氨水溶液（氨水∶水＝1 ∶1，体积比）调节样品的pH 值至8.0。

图1 显示了5 种浓缩果汁基质加标的MRM图，可见目标化合物无干扰峰影响。

2.2 质谱条件的确定

分别配制1 mg／L 的多菌灵、噻菌灵标准溶液，选择电喷雾离子源正离子模式，对雾化气温度、雾化气流量、源内碎裂电压及碰撞能量等条件进行优化。经反复测试、优化，得到2 种待测物的质谱条件（见表1）。

表1 多菌灵、噻菌灵的质谱优化条件Table 1 Optimized MS／MS conditions of target compounds

2.3 线性关系、检出限和基质效应

外标法定量结果表明：多菌灵和噻菌灵在0.5～10 μg／kg 范围内具有良好的线性关系。两种目标物在不同基质中的线性方程、相关系数和检出限见表2。

图1 5 种果汁加标样品的MRM 色谱图Fig.1 MRM chromatograms of the standards spiked in five kinds of juices

由表2 可见，多菌灵在不同基质中的检出限（LOD）（取不同基质的空白样品，在相应的出峰时间处，计算得到相应的信噪比S／N，以3 倍信噪比的值作为不同基质的检出限）［17］在0.12 ～0.15 μg／kg 之间，而噻菌灵在不同基质中的检出限（LOD）（S／N＝3）在0.13 ～0.23 μg／kg 之间。

2.4 方法的准确度和精密度

表3 结果显示，在0.5、1.0 和5.0 μg／kg 添加水平下，多菌灵和噻菌灵的加标回收率为76.98%～108.7%，相对标准偏差（RSD）为2.95% ～9.99%，结果符合残留物分析的要求［17］。

表2 不同基质中多菌灵和噻菌灵的线性方程、相关系数（r）和检出限（LOD）Table 2 Regression equations，correlation coefficients （r）and limits of detection （LOD）of carbendazim and thiabendazole in different matrices

表3 不同样品中多菌灵和噻菌灵的加标回收率和相对标准偏差（n＝6）Table 3 Recoveries and RSDs of carbendazim and thiabendazole spiked in different samples（n＝6）

2.5 基质效应分析

基质效应是指样品中的一种或几种非待测组分对待测物浓度或质量测定准确度的影响。目前，基质效应的产生机制尚未完全研究清楚，研究人员也尝试通过各种手段来加以克服［13，15，18］，欧盟官方推荐使用同种基质的工作曲线校正来消除［17］。根据2.3 节中不同基质的基质标准曲线与溶剂标准曲线斜率比值η 绘制的柱状图，从图2 中可以看出苹果汁中两种目标物的η 在0.90 左右，接近1，表明基质效应不明显，说明苹果汁基质经过本方法处理后对质谱检测不会产生显著影响；而桃汁基质则对多菌灵具有明显的基质增强效应，对噻菌灵有明显的基质抑制效应；橙汁基质效应相反，对多菌灵具有明显的基质抑制效应，对噻菌灵有明显的基质增强效应。梨汁、葡萄汁基质对多菌灵、噻菌灵都具有明显的基质抑制效应。

图2 5 种果汁的基质效应Fig.2 Matrix effects of five kinds of juices

2.6 实际样品检测

通过使用标准方法［14］和本方法对市场购得的12 份实际样品进行检测，结果表明均无多菌灵和噻菌灵检出。

3 结论

本文采用乙酸乙酯提取、UHPLC-MS／MS 测定，建立了浓缩果汁中杀菌剂多菌灵和噻菌灵的快速检测方法。该方法具有提取时间短、溶剂用量少、萃取效率高的特点，提高了检测速度和检测通量。本方法适用于浓缩果汁中多菌灵和噻菌灵残留的检测。

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