香菇C91-3转录本Unigene 24277基因克隆表达及其生物学活性的研究

田 丽， 钟民涛， 刘 奔， 张 伟， 王晓丽， 李星云， 曹 婧， 宁安红， 黄 敏

(大连医科大学 微生物教研室，辽宁 大连 116044)



香菇C91-3转录本Unigene 24277基因克隆表达及其生物学活性的研究

田 丽， 钟民涛， 刘 奔， 张 伟， 王晓丽， 李星云， 曹 婧， 宁安红， 黄 敏*

(大连医科大学 微生物教研室，辽宁 大连 116044)

通过对香菇C91-3转录本Unigene 24277基因的生物信息学分析，克隆表达含RCC1结构域的Unigene 24277基因，并研究其抗肿瘤活性。从香菇C91-3菌丝体中提取总RNA，反转录合成cDNA，并利用Rapid Amplification of cDNA Ends(RACE)技术获得基因全长。NCBI数据库分析提示其含有RCC1结构域。PCR扩增RCC1结构域，将其克隆产物与pET-32a(+)载体连接，热转化至E.coilRosetta-gami(DE3)中诱导表达，纯化、复性后，通过MTT法研究其抗肿瘤活性。结果显示原核表达载体构建成功，重组蛋白成功诱导表达，并初步证明了重组蛋白具有抑制肿瘤细胞增殖活性的功能，为后续抗肿瘤机制的探究奠定了基础。

香菇C91-3；克隆；生物信息学；RCC1

香菇芳香独特，具有健脾益气，扶正祛邪，增强机体免疫力，防治癌症等功效[1]。目前，香菇多糖已作为临床药物应用于恶性肿瘤的辅助治疗。本课题组经多年研究从担子菌纲伞侧耳科真菌香菇中分离得到了1株食用真菌香菇，命名为香菇菌C91-3，并通过体内外实验证实其发酵液具有良好的抗肿瘤作用[2]。本课题组曾对发酵液中的多糖进行提取研究,发现此多糖是通过免疫调节来实现其体内抗肿瘤作用的，并无体外直接抗肿瘤作用。因此，本课题组希望能够开发香菇C91-3菌株中的有效抗肿瘤蛋白成分。利用基因功能组学对香菇C91-3转录组基因进行研究，通过solexa高通量转录组从头组装测序技术，对香菇菌C91-3的转录组序列进行检测，成功获得转录组Unigene序列，再利用生物信息学分析软件获取转录组中大量的Unigene对应的功能注释信息。目前，课题组已成功研究出来自香菇C91-3转录组的相关蛋白Unigene 24414具有促进肿瘤凋亡的作用[3]。本研究采用相同方法筛选出Unigene 24277基因，根据其序列设计引物，通过3′-Full RACE、5′-Full RACE方法获得基因全长，继而进行PCR扩增，将其产物与载体连接、转化至表达菌E.coliRosetta-gami(DE3)中。然后利用IPTG诱导蛋白表达，镍柱亲和层析得到纯化的单一蛋白，尿素梯度透析复性，3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyl-tetrazolium Bromide(MTT)实验证实其具有一定的抑制肿瘤细胞增殖的活性，为后续深入研究诱导肿瘤细胞凋亡活性及作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和菌株 克隆载体pMD-19-T Simple Vector购自TaKaRa(大连)公司，表达载体pET-32a(+)为本实验室保存，宿主大肠埃希菌DH5α为本实验室保存，宿主表达菌Rosetta-gami(DE3)购自TaKaRa(大连)公司。

1.1.2 试剂 总RNA提取Trizol试剂盒，3′-Full RACE Core Set Ver 2.0、5′-Full RACE Kit、BigDye Terminater V3.1购自invitrogen公司；Cycle Sequencing Kit、Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR、质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒及实验所需各种引物、酶类均购自宝生物工程(大连)有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)购自TIANGEN公司；酵母提取物、胰蛋白胨购自OXOID公司；Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒购自康为世纪；BCA蛋白含量检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。

1.1.3 实验设备 低温离心机(Eppendorf，德国)，PCR扩增仪(Takara Thermal Cycler TP600，Takara BIO INC．)，核酸电泳仪(Mupid，ADVANCE-BIO Co．，Ltd)，凝胶成像分析系统(北京六一实验仪器厂)，紫外分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 筛选Unigene 24277基因 将香菇C91-3转录组中的大量Unigene基因进行功能注释，成功筛选出Unigene 24277基因。

1.2.2 香菇C91-3菌株总RNA提取及引物设计 取综合马铃薯培养基培养18 d的香菇C91-3菌株的菌丝体，在研钵中加入液氮充分研磨，利用Trizol试剂盒，按照说明进行一步法提取总RNA，将所得总RNA溶于50 μL DEPC水中。根据转录组测序结果，采用Oligo 6.0软件，设计合成3′-RACE、5′-RACE实验所需特异性引物。引物序列见表1。使用3′-Full RACE Core Set Ver 2.0、5′-Full RACE Kit试剂盒。将3′-Full RACE反应和5′-Full RACE反应获得的基因片段拼接，将所得基因全长测序。

表1 引物序列

1.2.3 Unigene 24277基因全长的生物信息学分析 应用DNAstar软件对Unigene 24277基因编码产物进行分析，再利用NCBI数据库对Unigene 24277蛋白序列进行比对，分析其同源性及可能包含的功能域。

1.2.4 亚克隆目的基因Unigene 24277中的RCC1结构域 ①引物设计与合成：根据Unigene24277基因中染色体浓缩调控蛋白(Regulator of chromosome condensation,RCC1)结构域的核苷酸序列设计一对PCR特异性引物，引物序列见表1。②RNA反转录：使用TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0(Code No. D314)合成cDNA。反应体系：香菇菌丝体Total RNA 1 μg，3′ RACE Adaptor(5 μmol/L) 1 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L each) 1 μL，RNase Free dH2O 7.5 μL。反应条件：70 ℃，10 min，立即冰上放置2 min。然后加入下列组分：5×M-MLV Buffer 2 μL； RNase Inhibitor(40 U/μL) 0.25 μL，Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)(200 U/μL) 0.25 μL。反应条件：42 ℃，60 min，最后70 ℃，15 min。③PCR扩增目标基因：使用PrimeSTAR®HS DNA Polymerase(Code No.DR010S)，以所得到的cDNA为模板，以具有EcoRⅠ和XhoⅠ两个酶切位点的PCR反应引物进行PCR扩增。反应条件：98 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 5 min。PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳。并利用凝胶回收试剂盒将PCR产物纯化回收。

1.2.5 重组表达质粒的构建及鉴定 纯化的PCR产物与pET-32a(+)载体分别利用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切处理，然后将Unigene 24277基因与pET-32a(+)载体相连并转化到大肠埃希菌Rosetta-gami(DE3)感受态细胞中，同时将单独的质粒pET-32a(+)也转入Rosetta-gami(DE3)中作为空载体阴性对照，分别涂布于含4种抗生素(羧苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素)的LB平板上。筛选阳性克隆，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，37 ℃过夜培养。提取质粒并进行酶切鉴定，并将含RCC1的重组质粒命名为pET-32a(+)-RCC1，将不含RCC1的空载体质粒命名为pET-32a(+)。同时将Rosetta-gami(DE3)单纯菌种接种于三抗(四环素、氯霉素、卡那霉素)培养基中相同条件下培养，提取质粒，用于辅助重组质粒鉴定。

1.2.6 重组蛋白的诱导表达 从阳性克隆平板及阴性对照平板上分别挑取单个菌落，接种于含4种抗生素的LB培养基中，37 ℃，120 r/min振荡培养过夜，按10%接种量接入含相应抗生素的LB培养基中培养至对数生长期，加入1 mmol/L的IPTG，于37 ℃诱导2、4、6 h，4 ℃离心收集细菌，并利用12% SDS PAGE电泳及Western Blot检测重组蛋白诱导情况。

1.2.7 重组蛋白纯化及复性 利用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒(包涵体蛋白)纯化。因层析柱对重组蛋白末端的His-tag标签具有亲和性，使得重组蛋白与杂蛋白得到分离。依照试剂盒说明操作：首先利用细菌裂解液破菌，然后将沉淀重悬于Binding buffer中，使包涵体充分溶解，收集上清液，加入层析柱，配制Binding buffer洗去杂蛋白，Elution buffer洗脱目的蛋白，最终得到纯化的单一蛋白。将无活性的包涵体蛋白利用尿素梯度透析的方法复性，冷冻干燥浓缩。

1.2.8 重组蛋白活性的初步鉴定 利用BCA蛋白定量试剂盒检测目的蛋白浓度。MTT法检测重组蛋白对子宫颈癌Hela细胞的细胞毒作用。取对数生长期的Hela细胞，调整细胞数至5×104个/mL，加入96孔培养板中，每孔100 μL。待细胞单层铺满孔底，以RPMI-1640作为阴性对照，用RPMI-1640调整蛋白浓度分别为12.5、25、50、100、200 μg/mL作为实验组。每组设4个复孔，置于37 ℃、5% CO2孵箱中分别孵育24和48 h，然后每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5% MTT)，继续培养4 h。终止培养，弃去孔内培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡器振荡10 min后在酶标仪589 nm处测量各孔的吸光值。按照下面公式计算抑瘤率：IR(inhibited rate)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。利用spss13.0软件分析其统计学意义。

2 结果与分析

2.1 Unigene 24277基因全长的获得

按照1.2.2方法获得3′-Full RACE和5′-Full RACE基因片段，再进行1.0%琼脂糖凝胶电泳(如图1)进行验证。将3′-Full RACE和5′-Full RACE获得的基因片段拼接，经测序Unigene 24277基因全长为1 215 bp。

图1 RACE结果Fig.1 The result of RACEA：M：DL2 000 DNA Marker；1：3′-Full RACE PCR 产物(M-MLV-)；2：3′-Full RACE PCR 产物(M-MLV+)。B：M：DL2 000 DNA Marker；1：5′-Full RACE PCR 产物(M-MLV-)；2：5′-Full RACE PCR 产物(M-MLV+)A：M：DL2 000 DNA Marker；1：The PCR product of 3′-Full RACE(M-MLV-)；2：The PCR product of 3′-Full RACE(M-MLV+).B：M：DL2 000 DNA Marker；1：The PCR product of 5′-Full RACE(M-MLV-)；2：The PCR product of 5′-Full RACE(M-MLV+)

2.2 序列全长及亚克隆目的基因的生物信息学分析

使用NCBI数据库检索序列全长核苷酸相似性，结果显示并无相似性的基因序列，表明此基因是一新型基因。通过NCBI数据库预测功能结构域(如图2)，结果显示Unigene 24277蛋白具有RCC1结构域，该结构域具有杀伤肿瘤细胞、调节机体免疫力、调节细胞周期及抗肿瘤等多种生物学功能。亚克隆目的基因Unigene 24277中的RCC1结构域所对应的核酸序列大小为720 bp，翻译成240个氨基酸，预测大小约为26 kDa。

图2 Unigene 24277氨基酸序列在NCBI数据库Blast结果Fig.2 The result of Unigene 24277 amino acid sequence blast in NCBI database

2.3 重组表达质粒的构建及鉴定结果

按照1.2.5方法培养连接并转化好的E.coliRosetta-gami(DE3)菌株及未转化的E.coliRosetta-gami(DE3)菌株。提取质粒进行酶切验证，1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测(如图3)。由于E.coliRosetta-gami(DE3)菌株自身含有一个质粒，且具有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，因此电泳显示双酶切后的重组质粒有4条条带，与图4中的第4泳道对比，可知其中第2、3条带为菌株自身酶切后条带，第1、4条带为重组质粒酶切后条带，第4条带处于720 bp左右位置，与目的条带大小一致，证明重组原核表达载体构建成功。

2.4 重组蛋白表达及鉴定

重组蛋白阳性转化菌及空载体阴性对照菌经IPTG诱导表达，产物经12% SDS PAGE检测(如图4)，与阴性对照比较，在相对分子质量46 kDa左右有明显的重组蛋白表达条带，比RCC1结构域片段大20 kDa左右，为连接的载体pET-32a(+)大小。通过Western Blot进一步证明该蛋白条带为所要目的条带(如图5)，说明重组蛋白诱导表达成功。

2.5 重组蛋白纯化

重组蛋白经镍柱亲和层析纯化后产物用12% SDS PAGE鉴定，结果(如图6)显示在洗脱液第3、4、5管得到单一的目的蛋白，表明蛋白纯化成功。

图3 重组质粒双酶切Fig.3 Recombinant plasmid digested with EcoRⅠ和XhoⅠM：DL8 000 DNA Marker；1： 未酶切的重组质粒；2：双酶切的重组质粒；3：未酶切的E.coli Rosetta-gami(DE3)质粒；4：双酶切的E.coli Rosetta-gami(DE3)质粒M：DL8 000 DNA Marker；1：Not be digested of Recombinant plasmid；2：Double digested of recombinant plasmid；3：Not be digested of E.coli Rosetta-gami(DE3)plasmid；4：Double digested of E.coli Rosetta-gami(DE3) plasmid

图4 SDS PAGE鉴定表达产物Fig.4 SDS PAGE identification of expression productsM：Protein molecular wight maker(low)；1：诱导6 h的空载体-阴性对照；2：未诱导的重组蛋白；3：诱导2 h的重组蛋白；4：诱导4 h的重组蛋白；5：诱导6 h重组蛋白M：Protein molecular wight maker(low)；1：Empty vector after induced 6 h-negative control；2：Not be induced of the recombinant proteins；3：The recombinant proteins after induced 2 h；4：The recombinant proteins after induced 4 h；5：The recombinant proteins after induced 6 h

图5 Western Blot鉴定表达产物Fig.5 Western Blot identification of expression products1：诱导2 h重组蛋白；2：诱导4 h重组蛋白；3：诱导6 h重组蛋白；4：诱导6 h空载体-阴性对照1：The recombinant proteins after induced 2 h；2：The recombinant proteins after induced 4 h；3：The recombinant proteins after induced 6 h；4：Empty vector after induced 6 h-negative control

图6 重组蛋白的纯化Fig.6 Purification of recombinant proteins1：Protein molecular wight maker(low)；2：binding重悬上清液；3：流穿液；4：洗脱第1管；5：洗脱第2管；6：洗脱第3管；7：洗脱第4管；8：洗脱第5管1：Protein molecular wight maker(low)；2：The binding supernatant after resuspended；4：The first tube eluent；5：The second tube eluent；6：The third tube eluent；7：The fourth tube eluent；8：The fifth tube eluent

2.6 重组蛋白抗肿瘤活性初步鉴定

按照1.2.8，利用MTT法检测重组蛋白对Hela细胞的增殖抑制活性。统计学结果(图7)显示，重组蛋白对Hela细胞生长具有明显的抑制作用，且其抑制作用随着质量浓度和时间的加大而增大，存在一定的浓度和时间依赖性，当质量浓度为200 μg/mL，培养48 h后，抑瘤率可达62.6%，与对照组比较，各质量浓度差异均具有显著性。

图7 不同质量浓度重组蛋白作用Hela细胞后的MTT结果Fig.7 The MTT result of Hela cells after treated with different concentrations of recombinant proteins

3 讨 论

目前，恶性肿瘤发病率逐年升高，控制及治疗肿瘤是医学领域亟待解决的一个重要问题。最近研究发现，香菇能提高机体的免疫力，阻止癌细胞发生，对已诱发的癌细胞亦有抑制作用[4]。本研究主要是为了开发香菇C91-3转录组中的一条与抗肿瘤相关的基因。通过提取香菇C91-3菌丝体总RNA，反转录合成cDNA，利用RACE方法获得基因全长，生物学信息分析后，预测其具有RCC1结构域，PCR扩增获得较纯且浓度较高的RCC1结构域序列片段。本研究利用PET-32a(+)构建了原核表达载体，该表达载体具有生长速度快、表达能力强、操作方便、成本低廉等优点，是目前比较成熟的表达系统[5-6]，同时使用E.coliRosetta-gami(DE3)表达宿主菌，加强了原核表达蛋白的稳定性[7]。本研究成功将重组蛋白诱导表达并对其活性进行了初步鉴定，其结果显示Unigene 24277蛋白对Hela细胞具有明显抑制肿瘤生长的作用，同时也证明了包涵体蛋白Unigene 24277复性成功，具有一定抗肿瘤活性。

RCC1是目前唯一已知的Ran鸟嘌呤核苷酸交换因子。RCC1是位于间期细胞核内与染色体结合的蛋白，能够调节RanGDP到RanGTP的转换，在细胞核内输、外运，有丝分裂期纺锤体的形成及核膜的重组，防止S期DNA多重复制等过程中发挥作用。RCC1作为细胞周期调节因子在许多机体的细胞中发挥作用[8-9]，但目前仍未发现有关RCC1与肿瘤细胞关系的明确报道。细胞周期的改变可能导致多种疾病的发生，如癌症。本研究发现含有RCC1结构域的Unigene 24277蛋白具有明显的抗肿瘤细胞作用，该蛋白是否是通过RCC1结构域功能影响肿瘤细胞周期，从而引起细胞凋亡或坏死达到抑制肿瘤的目的，其详细机制有待今后进一步研究。

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Cloning, Expression & Bio-Activity Study on Unigene 24277 Gene from Xianggu mushroom (Lentinula edodes) C91-3Transcript

TIAN Li, ZHONG Min-tao, LIU Ben, ZHANG Wei, WANG Xiao-li, LI Xing-yun, CAO Jing, NING An-hong, HUANG Min

(Teach. &Res.Div.ofMed.Microbiol.,DalianMed.Uni.,Dalian116044)

Xanggumushroom (Lentinulaedodes) C91-3gene transcripts Unigene 24277 was cloned and expressed in Unigene 24277 gene of RCC1 structure domain through bioinformatic analysis and studied its anti-tumor activity. Total RNA was extracted fromL.edodesC91-3mycelium, cDNA was synthesized by reverse transcription and obtained the full-length gene by Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) technology. The NCBI database analysis indicated that it contains RCC1 structure domain. Amplified the RCC1 structure domain by PCR and connected the cloned products with pET-32a (+) vector, thermal conversion intoE.coliRosetta-gami (DE3) to induce expression, after purification and refold, its anti-tumor activity was studied by MTT method. The results showed that prokaryotic expression vector was constructed successfully and successfully induced the expression of recombinant proteins. It was preliminary proved that the recombinant protein possessed the function of inhibiting tumor cell proliferation, and laid a foundation for the follow-up study on the exploration of the mechanism of anti-tumor.

xianggumushroom (Lentinulaedodes) C91-3; cloning; bioinformatics; RCC1

国家自然科学青年基金项目(81301955)

田丽 女，硕士研究生。主要研究方向为生物因素抗肿瘤。E-mail: tian_li_good@yeah.net

* 通讯作者。男，教授，博士生导师。主要研究方向为生物因素抗肿瘤。Tel：0411-86110007，E-mail: huangminchao@163.com

2014-10-29；

2015-01-12

Q935

A

1005-7021(2015)05-0047-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.05.009