具抗菌及乙酰胆碱酯酶抑制活性珊瑚真菌的筛选

班海侠， 钟 敏， 雷晓凌， 陈 芳， 蔡加怡

(广东海洋大学食品科技学院 广东省水产品加工与安全重点实验室 水产品深加工广东普通高等学校重点实验室，广东 湛江 524088)



具抗菌及乙酰胆碱酯酶抑制活性珊瑚真菌的筛选

班海侠， 钟 敏， 雷晓凌*， 陈 芳， 蔡加怡

(广东海洋大学食品科技学院 广东省水产品加工与安全重点实验室 水产品深加工广东普通高等学校重点实验室，广东 湛江 524088)

为开发利用珊瑚真菌资源，以徐闻珊瑚保护区珊瑚样品中分离鉴定的43株海洋真菌为研究对象，采用双层平板法和Ellman法分别对其进行抗菌和乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制活性筛选。结果显示，43株菌株至少对一种指示菌有抑制作用，且有12株菌株对革兰阳性菌和革兰阴性菌均表现出不同程度的抗菌活性，抗菌谱较广；当浓度为1 mg/mL时，有8株菌株的发酵液提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制率达到50%以上。其活性菌株中曲霉属(Aspergillus)为优势属。

珊瑚真菌；抗菌活性；乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制活性；筛选

海洋微生物因独特的环境(高盐、高压、寡氧、低温等)使其产生许多结构新颖、活性特异的次级代谢产物。据不完全统计，2010年1月至2013年2月已报道895个海洋微生物新化合物，其中576个来源于海洋真菌，占64.36%，这说明海洋真菌是产生新化合物的巨大宝库[1-2]。作为海洋天然产物来源之一的珊瑚，资源丰富且种类较多，其粘液层、骨架和组织中都容纳着丰富的微生物[3-4]，具有极大的开发潜力。目前已报道的珊瑚共附生真菌的生物活性主要包括抗菌、抗氧化、酶抑制、抗肿瘤以及抗病等多种生物活性作用。徐佳[5]对丛生盔型珊瑚分离出的19株共附生真菌进行酶抑制活性研究，研究结果表明，有4株共附生真菌同时对乙酰胆碱脂酶和葡萄糖苷酶具有抑制活性。肖胜蓝[6]从普哥滨珊瑚、扁缩滨珊瑚、牡丹珊瑚3个珊瑚样品中共分离到54株真菌，对其进行抗菌实验的研究，共筛选到13株珊瑚真菌具有抗菌活性。本文对徐闻珊瑚保护区珊瑚样品中分离到的43株海洋真菌进行研究，从中筛选出具抗菌及乙酰胆碱酯酶抑制活性的产生菌，为今后开发珊瑚真菌的应用提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种来源 43株珊瑚共附生真菌均为本课题组分离鉴定并保存，分别分离自普哥滨珊瑚(Poritespukoensis)、扁缩滨珊瑚(Poritescompressa)、牡丹珊瑚(Pavonalamarck)、丛生盔形珊瑚(Galaxeafascicularis)。

1.1.2 培养基 ①PDA培养基;②PDB培养基：200 g新鲜马铃薯，去皮切片，煮沸30 min，纱布过滤去渣，加入20 g蔗糖，定容至1 000 mL，pH自然，作为发酵培养基。以上培养基均采用70%的海水进行配置。

1.1.3 抗菌活性检测指示菌 金黄色葡萄球菌(Staphlococcusaureus)、大肠埃希菌(Escherichiacoli)，本实验室保存菌种；SL1(登录号：FJ404757.1，Pesudomonassp.)、SL2(登录号：EF032-685.1,Kurthiagibsonii)、SL4(登录号：HM625714.1,Chryseobacteriumsp.)，本课题组从冷冻对虾中分离及鉴定的优势腐败菌。

1.1.4 试剂 乙酸乙酯、甲醇、氯仿、石油醚、正丁醇，均为分析纯，广州华大化学试剂有限公司；碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，国药集团化学试剂有限公司；乙酰胆碱酯酶(AChE)、5,5′-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)、碘化硫代乙酰胆碱(ATCh)、石杉碱甲，北京索莱宝生物科技有限公司等。

1.1.5 仪器设备 N-1100 旋转蒸发仪(上海爱郎仪器有限公司)；DC-R 氮吹仪(上海安谱科学仪器有限公司)；Multiskan MK3 酶标仪(上海雷波分析仪器有限公司)；PHS-2C 精密酸度计(上海大普仪器有限公司)；722型分光光度计(上海仪电科学仪器股份有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 珊瑚共附生真菌粗提物的制备 将供试菌在PDA斜面培养基上28 ℃活化培养3～4 d，挑取2～3环分别接种到含100 mL PDB的250 mL三角烧瓶中，于28 ℃、160 r/min摇床培养9 d。培养液经抽滤得到菌丝体和发酵液，发酵液分别用等体积的乙酸乙酯萃取3次，有机相经减压浓缩至干，称质量，适量甲醇溶解后得到100 mg/mL的待测样品。抗乙酰胆碱酯酶活性测试前再用甲醇适当稀释为不同浓度的溶液，备用。

1.2.2 指示菌菌悬液的制备 供试菌在LB斜面培养基上传代培养一次后，将其接种到LB液体培养基中37 ℃震荡培养12～18 h，再用LB液体培养基将指示菌稀释至细菌数为106cfu/mL。

1.2.3 抗菌活性菌株的筛选 采用双层平板法[7-8]，首先制备琼脂无菌平板，在平板上放置无菌牛津杯，然后采用稀释倒平板法制备含菌平板，按照需要分别将上清发酵液100 μL加入到牛津杯中。每组实验重复3次，并设阴性对照(不加粗提物)。细菌指示菌平板放置于37 ℃恒温培养。48 h后观察结果，测量并记录抑菌圈直径。

1.2.4 乙酰胆碱酯酶抑制活性菌株的筛选 通过改进Ellman法[9]进行乙酰胆碱酯酶活性的测定。在96孔板中先加入140 μL 0.1 mol/L、pH 8的磷酸盐缓冲液(PBS)，再加入20 μL待测样品溶液和15 μL 1.25 U/mL的乙酰胆碱酯酶溶液，震荡均匀后置于4 ℃培养20 min。再分别加入10 μL DTNB和10 μL ATCh，37 ℃反应20 min，于酶标仪405 nm下读取吸光度值(A)。用15 μL 0.1 mol/L、pH 8的PBS代替酶溶液, 为样品本底对照孔；20 μL 125 μg/mL的石杉碱甲溶液代替20 μL待测样品，为完全抑制对照孔；空白对照用20 μL 0.1 mol/L、pH 8的PBS代替待测样品。

抑制率计算公式：

抑制率(%)=

2 结果与分析

2.1 珊瑚真菌抗菌活性菌株的筛选

各菌株发酵液萃取物的抗菌活性筛选结果如表1所示。这43株菌株均对一种或多种指示菌表现出抑制作用，其中对SL1(Pesudomonassp.)有抗菌活性的菌株最多，共有38株，占抗菌活性菌株数的88.38%，并且分布的菌株种群多，涉及14个属；其次是拮抗SL2(Kurthiagibsonii)、SL4(Chryseobacteriumsp.)菌株，分别有37株和32株；对大肠埃希菌(Escherichiacoli)和金黄色葡萄球菌(Staphyloccusaureus)有抗菌活性的菌株较少，分别为15株和14株；有19株菌株对5种指示菌有拮抗作用。在具有抗菌活性的菌株中，具有中等活性(15 mm≤抑菌圈直径<25 mm)或高活性(抑菌圈直径≥ 25 mm)的菌株有31株，占有活性菌株的72.10%。

根据菌株来源，在抗菌活性菌株中，普哥滨珊瑚、扁缩滨珊瑚、牡丹珊瑚、丛生盔形珊瑚各有19株、13株、4株和7株。曲霉(Aspergillus)是4种珊瑚共有的属，共有14株为优势属，占活性菌株的32.56%；普哥滨珊瑚和扁缩滨珊瑚的活性菌株种群分布最丰富，各有8属，其中旋孢腔菌属、硬孔菌属、蕉孢壳属、弯孢属只在扁缩滨珊瑚中有分布；白念菌属、香菇菌属、担子菌属仅在扁缩滨珊瑚中有分布；丛生盔形珊瑚中有4个属，座囊霉菌属、透孢黑团壳、葡萄穗霉属只出现在丛生盔形珊瑚。

续表1

注：菌株编号为Cxy-z，C代表珊瑚样品，x为采样的批次，y为同批次采样珊瑚样品号，1～4分别代表珊瑚样品为普哥滨珊瑚、扁缩滨珊瑚、牡丹珊瑚、丛生盔形珊瑚,z为分离菌株的编号，表2同

2.2 珊瑚真菌乙酰胆碱酯酶抑制活性的筛选

采用改进的Ellman法对43株珊瑚真菌发酵液乙酸乙酯萃取物进行抗乙酰胆碱酯酶活性筛选，结果见表2。结果表明，在一定浓度下，各菌株发酵液乙酸乙酯萃取物对乙酰胆碱酯酶抑制活性存在较大的差异，且其抑制率随萃取物浓度的降低呈现逐渐降低的趋势；当测定浓度为1 mg/mL时，有23株菌株表现出酶抑制活性，占菌株总数的53.49%，其中8株有较强的活性(抑制率>50%)，分别为C21-5、C21-11、C22-4、C21-2、C21-9、C22-5、C22-3、C14-22，抑制率依次为71.34%、66.13%、59.89%、58.92%、58.25%、57.25%、56.15%、51.34%，其余菌株活性较弱；这8株菌中，曲霉属有4株，占其菌株总数的50%，枝顶孢属、旋孢腔菌属、硬孔菌属、座囊霉菌属各1株。

表2 43株珊瑚真菌乙酰胆碱酯酶抑制活性

续表2

注：“—”表示在所测定浓度下对乙酰胆碱酯酶无抑制活性

3 讨 论

目前，发现的活性真菌主要分布在拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、曲霉属(Aspergillus)、色疣节梗孢属(Gonatobotryum)等8个属中[6]。本研究从珊瑚中筛选到的43株海洋真菌均对至少一种指示菌有抑制作用，曲霉(Aspergillus)是4种珊瑚共有的属，共有14株为优势属，占活性菌株的32.56%；同时抗菌活性菌株中有19株具有广谱抗菌作用，能对5株指示菌有不同程度的拮抗作用，其中曲霉属有7株，占36.85%，比例最高。

20世纪90年代后期，日本研究人员首次尝试从微生物及代谢产物中筛选AChEI并获得成功[10]，但国内外从海洋微生物中筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的研究报道较少。本研究从43株珊瑚海洋真菌中筛选到23株菌株对乙酰胆碱酯酶有抑制作用，其中8株菌株活性较好，当质量浓度为1 mg/mL时，发酵液提取物对乙酰胆碱酯酶的抑制率达50%以上，表明珊瑚海洋真菌对乙酰胆碱酯酶抑制剂的研究具有潜力。此外，测定分析的菌株均对细菌有抑制活性，为进一步的研究奠定基础。

[1] 刘楠, 李英新, 李志勇, 等. 珊瑚来源真菌天然产物及其活性的研究进展[J]. 中国海洋药物, 2014, 33(4):73-84.

[2] Zhao C, Zhu W. Marine Natural Products of Microbial Origin from 2010-2013[J]. Chinese Journal of Organic Chemistry，2013, 33:1195.

[3] 滕宪存, 庄以彬, 王乂, 等. 花刺柳珊瑚共生真菌Penicilliumsp.的次生代谢产物研究[J]. 中国海洋药物杂志, 2010, 8(29): 11-13.

[4] Shapo J L, Moeller P D, Galloway S B. Antimicrobial activity in the common seawhip, Leptogorgia virgulata(Cnidaria: Gorgonaceae)[J].Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 2007, 148(1):65-73.

[5] 徐佳. 珊瑚共附生可培养真菌菌群多样性及其生物活性研究[D]. 湛江: 广东海洋大学, 2011.

[6] 肖胜蓝. 徐闻3种石珊瑚共附生可培养真菌多样性及其抗菌活性的研究[D]. 湛江：广东海洋大学, 2012.

[7] Nolte FS, Metchock B, Mycobacterium MP.Manual clinic microbiol[M].Washington, D.C.：American Society for Microbiology,1995:400-413.

[8] CLSI, Clinical and Laboratory Standards Institute.Reference methods for broth dilution antifungal susceptibility tests of yeasts:Approved Standar[C]. USA:National Committee for Clinical Laboratory Standards,2002.

[9] 杨明俊, 路鑫龙, 王永刚，等. 水仙内生真菌乙酰胆碱酯酶抑制活性菌株的筛选及鉴定[J]. 中国药理学通报, 2013, 29(10): 1461-1464.

[10]熊枫. 深海沉积物真菌活性菌株的筛选及菌株WP-K-3的次生代谢产物的初步研究[D]. 厦门：厦门大学, 2006.

Screening of Coral Fungi with Antibacterial and AChE Inhibitory Activities

BAN Hai-xia, ZHONG Min, LEI Xiao-ling, CHEN Fang, CAI Jia-yi

(Coll.ofFoodSci. &Technol.,GuangdongOceanUni.,GuangdongProv.KeyLab.ofAquaticProductProcess. &Safety,KeyLab.ofAdvancedProcess.ofAquaticProductsofGuangdongInst.ofHigherLearning,Zhanjiang524088)

In order to develop coral fungi resources, the antibacterial and AChE inhibitory activities of 43 marine fungi isolated from Xuwen Coral National Nature Preserved Area were determined by agar diffusion assay and Ellman methods, respectively. The results showed that 43 strains of fungi had antibacterial activity against at least one indicator strain, among them twelve strains were found to have different degree of antibiotic activities against both Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria with fairly broad antibiogram; when the concentration was at 1 mg/mL, the extracts of fermentation broth from eight strains showed that the AChE inhibition rates were more than 50%.Aspergillusstrains were the dominant genus among these active strains.

coral fungus; antibacterial activity; AChE inhibitory activity; screening

广东省科技计划项目(2013B021100015)；湛江市财政资金科技专项竞争性分配项目(2013C01023)

班海侠 女，硕士研究生。研究方向为海洋生物活性物质研究。E-mail：syuanbhx@163.com

* 通讯作者。女，博士，教授，硕士生导师。主要从事海洋生物活性物质、水产品安全控制等。E-mail：leixlteam@126.com

2015-01-29；

2015-03-20

Q936

A

1005-7021(2015)05-0023-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.05.005