氟曲马唑对足癣分离病原菌的体外抗菌活性研究

李亚丽 万喆 陈伟 王爱平 李若瑜（北京大学第一医院皮肤性病科，北京大学真菌与真菌病研究中心，皮肤病分子诊断北京市重点实验室，北京100034）



氟曲马唑对足癣分离病原菌的体外抗菌活性研究

李亚丽 万喆 陈伟 王爱平 李若瑜
（北京大学第一医院皮肤性病科，北京大学真菌与真菌病研究中心，皮肤病分子诊断北京市重点实验室，北京100034）

【摘要】目的 评价氟曲马唑对足癣分离病原菌的体外抗菌活性，并与联苯苄唑相比。方法 采用CLSI推荐的M⁃38 A2（皮肤癣菌）和M27⁃A3（酵母菌）微量液基稀释法对病原菌进行体外药物敏感性测定。结果 氟曲马唑对红色毛癣菌最小抑菌浓度（MIC）范围为0．031～2 μg／mL，MIC50为0．5 μg／mL，MIC90为1 μg／mL，GM值为0．637 μg／mL；联苯苄唑分别为0．031～16 μg／mL，0．25 μg／mL，2 μg／mL，0．634 μg／mL；两药对红色毛癣菌MIC GM值比较差异无统计学意义（P＝0．974）。氟曲马唑对趾（指）间毛癣菌MIC范围为0．031～1 μg／mL，MIC50为0．031 μg／mL，MIC90为0．5 μg／mL，GM值为0．17 μg／mL；联苯苄唑分别为0．125～16 μg／mL，1 μg／mL，2 μg／mL，1．886 μg／mL；两药对趾（指）间毛癣菌MIC GM值比较差异具有统计学意义（P＝0．001）。尽管酵母菌菌株数偏少，但研究结果显示两药对念珠菌属和毛孢子菌属MIC GM值比较差异具有统计学意义（P＝0．000和P＝0．031）。结论 氟曲马唑对红色毛癣菌的抗菌活性与联苯苄唑相似，但对趾（指）间毛癣菌、念珠菌属和毛孢子菌属的抗菌活性明显优于联苯苄唑。

【关键词】氟曲马唑；联苯苄唑；皮肤癣菌；酵母菌；体外抗菌活性

[Chin J Mycol，2015，10（5）：272⁃275]

氟曲马唑（Flutrimazole）属于咪唑类抗真菌药物，其作用机制与其他咪唑类抗真菌药物相似，是通过抑制羊毛甾醇⁃14α⁃脱甲基酶的活性干扰真菌细胞膜麦角固醇的生物合成，从而引起真菌细胞膜的通透性增加，导致钾以及其他细胞内容物的流失[1]。氟曲马唑具有广谱抗真菌活性，尤其对皮肤癣菌、酵母菌有强的抗菌活性，对大多数真菌的MIC值为0．025～5．0 mg／L[1]。本研究对足癣临床研究中分离出的皮肤癣菌和酵母菌进行氟曲马唑和联苯苄唑体外药物敏感性试验，参照美国临床实验室标准化研究所（Clinical and Laboratory Stand⁃ards Institute，CLSI）制定的M38⁃A2（皮肤癣菌）和M27⁃A3（酵母菌）微量液基稀释法进行皮肤癣菌和酵母菌的最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）值测定。

1　 材料与方法

1．1 受试菌

受试菌株均来自于参加临床研究的足癣患者，共获得临床分离菌株312株。其中皮肤癣菌277株，包含红色毛癣菌（T．rubrum）242株、趾（指）间毛癣菌（T．interdigitale）34株、絮状表皮癣菌（Epi⁃dermophyton floccosum）1株。酵母菌35株，其中念珠菌属25株，包括白念珠菌（Candida albicans）13株、近平滑念珠菌（Candida parapsilosis）7株、热带念珠菌（Candida tropicalis）3株、未确定菌种念珠菌属2株，毛孢子菌属7株，包含阿萨希毛孢子菌（Trichosporon asahii）2株、黏液毛孢子菌（Trichos⁃poron mucoides）2株、皮瘤毛孢子菌（Trichosporon inkin）1株、未确定菌种毛孢子菌属2株，红酵母属（Rhodotorula spp．）2株，隐球菌属（Cryptococcus spp．）1株。全部菌株通过形态学及生理、生化特征鉴定。皮肤癣菌及酵母菌分别采用Trichophyton mentagrophytes ATCC⁃MYA⁃4439和C．parapsilosis ATCC 22019作为质控株。

1．2 培养基

按照CLSI方案要求采用RPMI⁃1640液体培养基。RPMI⁃1640粉（含谷氨酰胺，不含碳酸氢钠）10．4 g，三氮吗啉丙磺酸（MOPS）34．53 g，蒸馏水900 mL，NaOH调节pH至7．0，定容至1 000 mL，用直径0．2 μm的无菌滤器滤过除菌，置4℃冰箱备用。

1．3 药物

氟曲马唑纯品由江苏恩华药业股份有限公司提供，批号20111226；含量99．9%；贮藏：密封保存。联苯苄唑纯品（国家药品标准物质）由中国食品药品检定研究院生产，供含量测定用，105℃干燥2 h后使用，由江苏恩华药业股份有限公司提供。

1．4 药物溶液的制备

称取氟曲马唑或联苯苄唑的药粉溶解在二甲基亚砜（DMSO）中制成浓度1 600 μg／mL的药物原液。用RPMI⁃1640培养基稀释50倍至2倍于药物的终浓度（范围为0．031～16 μg／mL）。取0．1 mL各浓度药液分别加入96孔细胞培养板第1到第10列各孔，取0．1 mL不含药物的培养基加入第11列作为生长对照（阳性对照），取0．2 mL培养基加入第12列作为阴性对照。配制好的药敏板储存在⁃20℃备用。

1．5 菌悬液制备

为保证受试菌的纯度及活性，皮肤癣菌需在马铃薯葡萄糖琼脂基（PDA）上30℃培养5～7 d。用2．0～2．5 mL无菌生理盐水（NaCl浓度0．85%）反复冲击菌落，将菌悬液静置3～5 min后取上层不含菌丝片段的菌悬液，调整为0．5个麦氏浊度，其对应的孢子浓度为（0．4～5）×106CFU／mL，将此菌悬液用RPMI⁃1640稀释50倍得2倍终浓度。酵母菌则首先在PDA上35℃划线接种获取单克隆以保证其活力及纯度，挑取单克隆菌落再次接种在PDA 上35℃培养24～48 h。用无菌棉签蘸取菌落溶于无菌生理盐水中，混匀后调整菌悬液为0．5个麦氏浊度，对应孢子浓度为（1～5）×106CFU／mL，将此菌悬液用RPMI⁃1640先稀释20倍，再稀释50倍得2倍终浓度。将配置好的药敏板取出室温下融化，96孔培养板除第12列外，其余各孔均加入0．1 mL菌悬液，将培养板置于35℃恒温培养。

1．6 结果判断

皮肤癣菌4～7 d读结果，与生长对照相比80%生长抑制为终点进行结果判读。酵母菌24～48 h（隐球菌属需延长至70～74 h）读结果，与生长对照相比50%生长抑制为终点进行结果判读。只有当生长对照生长良好且质控菌株MIC值在规定范围内时，方认为试验成功，可进行结果判读。所有试验均做2次，同一菌株MIC值在2次试验不超过2个稀释度时认为相同。

1．7 统计学方法

采用SPSS Version 21进行统计学分析，通过描述统计得到MIC值范围、MIC几何均数值（GM值）、MIC50和MIC90，并应用配对样本的t检验完成对氟曲马唑和联苯苄唑GM值的比较。

2　 结 果

277株皮肤癣菌中，红色毛癣菌占87．4%，趾（指）间毛癣菌占12．3%，絮状表皮癣菌占0．3%。结果显示氟曲马唑对皮肤癣菌MIC范围为0．031～2 μg／mL，MIC50为0．5 μg／mL，MIC90为1 μg／mL，GM值为0．577 μg／mL。联苯苄唑分别为0．031～16 μg／mL、0．25 μg／mL、2 μg／mL、0．785 μg／mL。氟曲马唑与联苯苄唑对皮肤癣菌MIC GM值比较差异无统计学意义（P＝0．051＞0．05）。

氟曲马唑对红色毛癣菌MIC范围为0．031～2 μg／mL，MIC50为0．5 μg／mL，MIC90为1 μg／mL，GM值为0．637 μg／mL；联苯苄唑分别为0．031～16 μg／mL、0．25 μg／mL、2 μg／mL、0．634 μg／mL。对红色毛癣菌MIC GM值氟曲马唑与联苯苄唑比较，差异无统计学意义（P＝0．974＞0．05）。氟曲马唑对趾（指）间毛癣菌MIC范围为0．031～1 μg／mL，MIC50为0．031 μg／mL，MIC90为0．5 μg／mL，GM值为0．170 μg／mL；联苯苄唑分别为0．125～16 μg／mL、1 μg／mL、2 μg／mL、1．886 μg／mL。对趾（指）间毛癣菌MIC GM值氟曲马唑与联苯苄唑比较，差异具有统计学意义（P＝0．001＜0．05）。见表1。

表1　氟曲马唑与联苯苄唑对277株皮肤癣菌MIC值（μg／mL）Tab．1 MIC values of flutrimazole and bifonazole against 277 isolates of dermatophytes

35株酵母菌中主要为念珠菌属（25株）和毛孢子菌属（7株），氟曲马唑对念珠菌属的MIC范围为0．031～16 μg／mL，GM值为4．339 μg／mL。联苯苄唑分别为1～16 μg／mL和11．24 μg／mL，对念珠菌属MIC GM值氟曲马唑与联苯苄唑比较差异具有统计学意义（P＝0．000＜0．05）。氟曲马唑对毛孢子菌属的MIC范围为0．031～8 μg／mL，GM值为1．37 μg／mL；联苯苄唑分别为0．5～16 μg／mL和4．071 μg／mL，对毛孢子菌属的MIC GM值氟曲马唑与联苯苄唑比较差异具有统计学意义（P＝0．031＜0．05）。见表2。

3　 讨 论

有关氟曲马唑体外抗菌活性研究的相关文献报道很少，仅在早期的体外药敏试验显示氟曲马唑对大多数真菌的MIC范围为0．025～5．0 μg／mL，其中对趾（指）间毛癣菌的MIC值为0．6 μg／mL；对白念珠菌和热带念珠菌的MIC值为2．5 μg／mL和5．0 μg／mL。结果显示氟曲马唑的MIC值与克霉唑相似，较联苯苄唑低1个多梯度[1]。Alomar等[2]随机双盲研究显示1%氟曲马唑乳膏或1%联苯苄唑乳膏1次／d治疗皮肤真菌病，在治疗4周时总有效率1%氟曲马唑乳膏为73%，1%联苯苄唑乳膏为65%（P＝0．05）。

本研究采用CLSI方案评价了氟曲马唑的体外抗菌活性，不仅填补了氟曲马唑体外研究的空白，并与联苯苄唑进行了对比，结果显示氟曲马唑对皮肤癣菌总体的MIC GM值（0．577 μg／mL）与联苯苄唑的MIC GM值（0．785 μg／mL）结果相似，说明氟曲马唑对皮肤癣菌的体外抗菌活性与联苯苄唑相似。但对于皮肤癣菌不同的菌种，氟曲马唑和联苯苄唑显示了不同强度的抗菌活性，对于红色毛癣菌氟曲马唑的MIC GM值与联苯苄唑结果相似，但对趾（指）间毛癣菌的MIC GM值（0．170 μg／mL）明显低于联苯苄唑MIC GM值（1．886 μg／mL），说明氟曲马唑体外抗趾（指）间毛癣菌的活性明显优于联苯苄唑。

从临床表现为足癣的皮损中亦主要分离出念珠菌属和毛孢子菌属菌种，结果显示氟曲马唑对念珠菌属的MIC GM值（4．339 μg／mL）明显低于联苯苄唑的MIC GM值（11．24 μg／mL），说明氟曲马唑对念珠菌属菌种的体外抗菌活性明显优于联苯苄唑。氟曲马唑对毛孢子菌属的MIC GM值（1．37 μg／mL）亦明显低于联苯苄唑MIC GM值（4．071 μg／mL），尽管菌株数较少，初步的结果显示氟曲马唑对毛孢子菌属的体外抗菌活性优于联苯苄唑。

表2　氟曲马唑与联苯苄唑对35株酵母菌MIC值（μg／mL）Tab．2 MIC values of flutrimazole and bifonazole against 35 isolates of yeasts

体外抗菌活性研究显示氟曲马唑具有抗皮肤癣菌和酵母菌的活性。提示氟曲马唑对于红色毛癣菌的体外抗菌活性与联苯苄唑相似，其抗菌活性稳定，MIC90值为1 μg／mL，MIC值最高为2 μg／mL。而联苯苄唑的MIC90值亦为1 μg／mL，但分别有3株菌的MIC值为16 μg／mL，1株菌为8 μg／mL，2株菌为4 μg／mL，提示红色毛癣菌少数菌株对联苯苄唑可能有耐药性产生。氟曲马唑对于趾（指）间毛癣菌的抗菌活性明显优于联苯苄唑，MIC90值为0．5 μg／mL， MIC值最高为1 μg／mL。对于酵母菌而言，尽管菌株数较少，但结果提示氟曲马唑对于念珠菌属和毛孢子菌属菌种的体外抗菌活性明显优于联苯苄唑，对各个菌种情况如何有待今后进一步研究。

参考文献

[1] Dronda M A，Merlos M，Forn J，et al．In vitro and in vivo studies with flutrimazole，a new imidazole derivative with antifungal activ⁃ity[J]．Arzneimittel⁃Forschung，1992，42（6）：836⁃840．

[2] Alomar A，Videla S，Delgadillo J，et al．Flutrimazole 1%dermal cream in the treatment of dermatomycoses：a multicentre，double⁃blind，randomized，comparative clinical trial with bifonazole 1% cream．Efficacy of flutrimazole 1%dermal cream in dermatomyco⁃ses．Catalan Flutrimazole Study Group[J]．Dermatology，1995，190 （4）：295⁃300．

[本文编辑] 施 慧

·论著·In vitro activities of flutrimazole against fungal pathogens isolated from tinea pedisLI Ya⁃li，WAN Zhe，CHEN Wei，WANG Ai⁃ping，LI Ruo⁃yu

（Department of Dermatology and Venereology，Peking University First Hospital，Research Center for Medical Mycology，Peking Universi⁃ty，and Beijing Key Laboratory of Molecular Diagnosis of Dermatoses，Beijing 100034，China）

【Abstract】Objective To evaluate the in vitro activities of flutrimazole against fungal pathogens isolated from tinea pedis．Meth⁃ods In vitro drug sensitivities were determined using the broth microdilution methods according to the CLSI M38⁃A2（for dermato⁃phytes）and M27⁃A3（for yeasts）documents．Results When against Trichophyton rubrum，the range of minimum inhibitory concen⁃tration（MIC），MIC50，MIC90，and geometric mean（GM）MIC for flutrimazole were 0．031～2 μg／mL，0．5 μg／mL，1 μg／mL and 0．637 μg／mL；for bifonazole were 0．031～16 μg／mL，0．25 μg／mL，2 μg／mL and 0．634 μg／mL；no significant（P＝0．974）difference was found for the GM MIC between the two drugs．When against Trichophyton interdigitale，the range of MIC，MIC50，MIC90，and GM MIC for flutrimazole were 0．031～1 μg／mL，0．031 μg／mL，0．5 μg／mL and 0．17 μg／mL；for bifonazole were 0．125～16 μg／mL，1 μg／mL，2 μg／mL and 1．886 μg／mL；significant（P＝0．001）difference was found for the GM MIC between the two drugs．Even though there are a few number of yeast strains，this study showed that the two drugs had significant difference for the GM MIC against Candida spp．（P＝0．000）and Trichosporon spp．（P＝0．031）．Conclusion In vitro activity of flutrimazole was similar to bifonazole when against T．rubrum，but better than bifonazole when against T．interdigitale，Candida spp．and Trichosporon spp．．

【Key words】flutrimazole；bifonazole；dermatophytes；yeasts；in vitro

[收稿日期]2015⁃03⁃18

【文章编号】1673⁃3827（2015）10⁃0272⁃04

【文献标识码】A

【中图分类号】R 978．5

通讯作者：王爱平，E⁃mail：wangap＠medmail．com．cn

作者简介：李亚丽，女（汉族），博士研究生在读．E⁃mail：lyl2007happy＠126．com