棉籽粕浸提及固态发酵联合工艺的优化*

魏春，颜雨薇，张艳丽，汪钊

(浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江 杭州，310014)

在我国的蛋白原料资源中，棉籽粕占有极其重要的地位，年产总量超过600万t，居全球首位［1］。限制棉籽粕大量用于饲料的主要因素是其含有棉酚等抗营养因子。棉酚(gossypol)俗称棉毒素，是存在于棉籽色素腺体中的一种毒素。在有腺体棉籽中，棉酚约占棉仁质量的0.49% ～1.87%［2］。饲用棉籽粕最重要的一步处理，就是降低棉籽粕中棉酚的含量，特别是降低游离棉酚的含量。微生物发酵是降低棉酚含量的一种有效方法［3-5］。

棉籽粕中低聚糖主要是棉籽糖和水苏糖，含量分别约为6.91%和2.36%［6］。由于棉籽糖含有α-半乳糖苷键，而单胃动物缺乏α-半乳糖苷酶，无法被消化利用。大量棉籽糖的存在会影响动物对蛋白质的消化率、生长性能和动物肠道食糜通过速度等。因此，从棉籽粕中提取棉籽糖，可以提高提取后棉籽粕的饲用品质，同时可得到功能性低聚糖产品棉籽糖。

本研究将棉籽糖提取与提取后棉籽粕的固态发酵相结合，建立棉籽粕联合加工工艺。使用棉籽糖提取后的棉籽粕作为发酵原料，在提取得到棉籽糖的同时，也去除了部分棉酚。通过混合菌固态发酵进一步减少了棉籽粕中的棉酚含量，脱毒率达到饲用标准，棉籽粕饲用品质得以改善。

1 材料与方法

1.1 实验材料

棉籽粕:购于新疆石河子，粉碎，过60目筛。

菌株:植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum WZ011，CCTCC No:M 2011364)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermenti WZW004)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae WZW005)，均为实验室保藏菌株。

植物乳杆菌和发酵乳杆菌种子培养基(MRS):蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母浸出粉5 g、葡萄糖20 g、无水醋酸钠5 g、柠檬酸二铵 2 g、吐温-80 1 mL、MgSO40.58 g、MnSO40.25 g，用蒸馏水定容至1 L，调节pH为6.2～6.4，115℃灭菌30min。

酿酒酵母种子培养基(YPD):酵母浸出粉l0 g、蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，用蒸馏水定容至1 L，pH为7.0～7.2，115℃灭菌30 min。

固态发酵培养基:将粉碎过筛后的棉籽粕或经提取加工后的棉籽粕与麸皮60℃烘干至恒重，按9∶1质量比混合均匀，按料水比1∶1.2(w/w)添加含无机盐的水溶液。无机盐水溶液组成(L):2 g NaNO3，1 g MgSO4·7H2O，2 g K2HPO4，1 g NaCl，2 g FeSO4，0.6 g MnSO4和 0.4 g CuSO4·7H2O，pH 6.0。

植物水解酶(诺维信Viscozyme L)购自北京华章未央生物科技有限公司，含果胶裂解酶和各种碳水化合物酶，包括阿拉伯聚糖酶、纤维素酶、葡聚糖酶、半纤维素酶和木聚糖酶，酶活力为100 FBG/g;木瓜蛋白酶购自南宁庞博生物工程有限公司，酶活力100万u/g。

1.2 实验方法

1.2.1 棉籽粕预处理及棉籽糖的提取

酶预处理条件:在20 g棉籽粕中加入30 mL水，pH值调至5.5，再直接加入适量酶(棉籽粕质量的0.1%)，温度50℃，搅拌水解2 h。

取粉碎过筛的棉籽粕20 g，置于保温反应器中，加入70 mL的75%乙醇溶液，50℃搅拌状态下浸提一段时间后，静置5 min，倾出上层清液，再加入70 mL的乙醇溶液进行浸取，提取料液比1∶14(g∶mL)，浸出时间2 h。浸提4次后，8层纱布过滤，合并得到提取液总体积［7］。

以含1.4 mol/L柠檬酸(或其他酸)的75%乙醇溶液提取棉籽糖:首先配置1.4 mol/L的柠檬酸(或其它酸)溶液，再加入一定量的无水乙醇，使乙醇浓度为75%，随后的棉籽糖提取工艺同上。

1.2.2 种子培养

植物乳杆菌、发酵乳杆菌种子培养:将甘油保存的菌株活化后，接种于MRS液体种子培养基，厌氧培养，温度30℃，培养时间24 h。

酿酒酵母种子培养:将甘油保存的菌株活化后，接种于YPD液体种子培养基，厌氧培养，温度30℃，培养时间48 h。

1.2.3 棉籽粕的固态发酵

取发酵底物20 g平铺于250 mL三角瓶，接种植物乳杆菌、发酵乳杆菌和酿酒酵母，总接种量5%(v/w)，接种比例 4∶3∶3，30 ℃培养箱厌氧培养 48 h，中间翻料2次。发酵结束后的原料60℃烘干至恒重，再利用粉碎机将其粉碎并过60目筛，待测。

1.2.4 棉籽糖的纯化

取一定量棉籽糖粗提液置于圆底烧瓶中，加入适量水进行减压蒸馏，蒸出乙醇。蒸馏后的糖溶液用过量的质量分数25%的醋酸铅溶液沉淀蛋白，离心沉淀，重复3次至蛋白除尽，再用草酸除铅至无铅为止，定容到100 mL，分别测定定容后的棉籽糖浓度和棉酚含量。

取50 mL经上述纯化后的棉籽糖液于圆底烧瓶中，调pH至3.0，加入欲脱色棉籽粕质量5%的活性炭，恒温(50℃)进行棉籽糖液的脱色处理30 min。反应完后用滤纸过滤，得到棉籽糖脱色液，分别测定原料液和脱色液的棉籽糖浓度和棉酚含量［8］。

1.3 分析方法

1.3.1 棉籽糖浸出率的测定

以HPLC法测定溶液中棉籽糖的浓度［9］。仪器型号为Waters 2487，色谱柱为Thermo C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，检测器为紫外检测器(waters-2487);流动相为蒸馏水，流速1.0 mL/min;柱温30℃，进样量10 μL。棉籽糖浸出率:

η =V×C/(m ×θ)×100

式中:θ为棉籽粕中棉籽糖的百分含量;C为测定溶液中棉籽糖的浓度;V为合并得到提取液总体积;m为棉籽粕质量。

1.3.2 游离棉酚、总棉酚含量的测定及脱毒率计算

参照GB/T8314-2013［10］来测定游离棉酚和总棉酚含量。棉籽粕的脱毒率:

脱毒率 /%=(m1－m2)/m1×100

式中:m1为发酵前游离棉酚含量;m2为发酵后游离棉酚含量。

2 结果与讨论

2.1 三种棉籽粕加工方式的比较(表1)

对植物乳杆菌、发酵乳杆菌和酿酒酵母单菌株及菌株组合发酵进行了研究(数据未显示)，结果得到复合发酵效果要优于单菌发酵，3菌株复合发酵效果最优，其优势在于多菌株之间可相互补偿其缺陷，发挥了协同互生作用。植物乳杆菌和发酵乳杆菌发酵棉籽粕脱毒能力强，酿酒酵母发酵棉籽粕主要增加蛋白含量。张文举等［11］采用热带假丝酵母ZD-3和黑曲霉ZD-8复合发酵棉粕，结果显示复合发酵棉籽粕的综合发酵效果优于单菌株发酵，与本文研究结果一致，菌株复合发酵效果优于单菌发酵。

表1 不同棉籽粕加工方式的比较Table 1 Comparison of different processing methods with cottonseed meal

棉籽粕经过75%的乙醇浸提，不仅提取了大部分的棉籽糖，也带走了一部分的棉酚、颗粒物和少量水溶性棉籽蛋白等杂质。所以经过方式二和方式三的提取操作，不仅棉籽粕中的游离棉酚含量远低于方式一混菌发酵的结果，而且还能得到高附加值产物棉籽糖。方式二的棉酚脱毒率略低于方式三，但是棉籽糖浸出率和纯度远远高于方式三。可能原因是方式三中棉籽粕经过发酵，蛋白质和小肽等物质含量增加，提取过程杂质增加，故而棉籽糖的浸出率和纯度相对降低。综合考虑棉籽糖浸出率和棉酚脱毒率两项指标，确定方式二―先浸提后发酵联合工艺为最优的棉籽粕加工方式。

2.2 先浸提后发酵工艺中棉籽糖浸提条件的影响

2.2.1 酶预处理的影响

使用75%的乙醇溶液提取棉籽粕，虽然选择性好、渗透性强，但是能量消耗高;而辅以合适的酶处理，可分解棉籽粕结构，加速有效成分释放，提高棉籽糖浸出率。

比较了酶处理对棉籽糖浸提及发酵结果的影响，其中两种工艺分别辅以添加植物水解酶和木瓜蛋白酶，结果如表2。工艺二在浸提前加入植物水解酶进行预处理，可以提高棉籽糖浸出率，是单纯乙醇提取的104%，但大大降低了棉酚脱毒率，可能是植物水解酶的处理破坏了结合棉酚所致。植物水解酶含有较强的果胶裂解酶、碳水化合物酶和纤维素酶等，可加速糖分释放，从而可提高棉籽糖提取率。这一结果与温辉梁等研究结果一致［12］，果胶酶和纤维素酶分别是乙醇法提取的117%和139%。工艺三加入木瓜蛋白酶进行预处理反而显著降低了棉籽糖浸出率，推测可能是大量蛋白质和小肽的析出影响了棉籽糖的溶解。综合考虑棉籽糖浸出率和棉酚脱毒率两项指标，确定联合工艺中不进行酶的预处理。

表2 酶的预处理对棉籽糖浸提及发酵结果的影响Table 2 Effect of enzymatic pretreatment on raffinose extraction and fermentation results

2.2.2 含酸溶剂处理的影响

有文献报道使用酸水解棉酚席夫碱，为了提取棉籽粕中的棉酚，使用了溶剂、水和酸［12］。因此研究了含不同酸的乙醇溶液浸提棉籽粕，滤渣烘干后固态发酵，结果见表3。含1.4 mol/L柠檬酸的75%乙醇溶液浸提棉籽粕，棉籽糖浸出率最高(96.4%)，高于不含酸的75%乙醇溶液浸提水平;使用含盐酸的乙醇溶液，其棉籽糖浸出率略低于不含酸的浸提水平。使用含1.4 mol/L磷酸的75%乙醇溶液提取棉籽粕，棉籽糖浸出率只有24.34%，但是脱毒率可达96.23%，和Pelitire等报道的研究结果一致［13］，使用磷酸的乙醇溶剂提取棉籽粕可以有效降低90%～95%棉酚含量。磷酸的存在能显著提高棉酚的提取率，但是对棉籽糖的浸提效果非常差。综合考虑，确定含1.4 mol/L柠檬酸的75%乙醇溶液为最优浸提剂。

表3 含酸溶剂对棉籽糖浸提及发酵结果的影响Table 3 Effect of solvents containing different acid on raffinose extraction and fermentation results

2.3 浸提发酵工艺固态发酵阶段棉酚含量的变化

提取棉籽糖过后的棉籽粕固态发酵，植物乳杆菌、发酵乳酸杆菌和酿酒酵母的生长曲线见图1。植物乳杆菌和发酵乳酸杆菌在0～8 h菌株生长较为平缓，8～24 h快速生长，为菌株的对数生长期，24～44 h处于平稳期，几乎无变化，44 h后活细胞量有下降趋势。从图1可知酿酒酵母的生长较乳酸菌迟缓，在0～18 h生长较慢，18～48 h活菌数增长快速。棉籽粕发酵48 h结束时，乳酸菌总数可达到6×109CFU/g。

图1 植物乳杆菌、发酵乳杆菌和酿酒酵母发酵棉籽粕的生长曲线Fig.1 Growth curve of L.plantarum，L.fermenti and S.cerevisiae

提取棉籽糖过后的棉籽粕固态发酵，游离棉酚与总棉酚含量随时间变化的曲线如图2。游离棉酚和总棉酚随发酵时间的增加总体都呈下降的趋势，其中游离棉酚在发酵30 h后减少速率趋缓，对照图1，表明菌体生长速率可能和游离棉酚减少速率相关。游离棉酚的减少总量510 mg/kg小于总棉酚减少量1 549 mg/kg，推测在微生物固态发酵过程中，部分结合状态棉酚也被降解。

2.4 棉籽糖的纯化

含1.4 mol/L柠檬酸的75%乙醇溶液浸提棉籽粕得到的提取液棉籽糖纯度仅为33%，含有棉酚、棉籽蛋白、色素等大量杂质，因此需要进一步纯化，结果如表4所示。首先减压蒸馏蒸出乙醇，棉酚难溶于水，故而大部分棉酚在水相中析出。再经过除杂蛋白处理，得到颜色较浅、纯度提高、总棉酚含量约0.011 mg/mL的棉籽糖水溶液;最后通过活性炭脱色处理，棉籽糖纯度达到91.3%，且已检测不到棉酚。

图2 固态发酵中游离棉酚与总棉酚含量的时间变化过程Fig.2 Time course of content of free gossypol and total gossypol during solid-state fermentation

表4 棉籽糖纯化结果Table 4 Results of raffinose purification

3 结论

通过单纯的微生物固态发酵，游离棉酚含量由初始的1 274.7 mg/kg降低至158 mg/kg(表1)。通过本研究中棉籽粕浸提及固态发酵联合工艺，不仅进一步把棉籽粕中的游离棉酚含量从158 mg/kg降至118 mg/kg，而且可以得到96.4%浸出率的功能低聚糖棉籽糖。采用含1.4 mol/L柠檬酸的75%乙醇溶液提取棉籽粕中的棉籽糖，相比于75%乙醇溶液提取，棉籽糖浸出率从90.7%提高到96.4%，增加了6.3%。在48 h的固态发酵过程中，游离棉酚和总棉酚含量均随发酵时间的增加而下降。

本研究首次将棉籽糖提取与固态发酵脱毒建立关联，一方面从棉籽粕中提取得到了棉籽糖，另一方面，所得的发酵棉籽粕脱毒率高、棉籽糖含量低，提高了棉籽粕作为大宗蛋白饲料的饲用品质。

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