不同菌种发酵对海棠果果醋风味品质的影响

韩瑨烜，田洪磊，詹萍，程卫东

(新疆石河子大学食品科学与工程学院，新疆石河子，832000)

海棠果果醋是以海棠果为原料，经过酒精发酵和醋酸发酵，制成一种具有轻微酒精度的果醋饮料，具有促进新陈代谢，调节酸碱平衡，消除疲劳，降低胆固醇和血压，增强肌体免疫力，防癌、抗菌消炎、美容护肤、延缓衰老、减肥等作用［1］。海棠果果醋的特点为呈现明显的海棠果果香，营养丰富并具备果醋产品的一贯优点。

本文在前期海棠果果醋加工技术研究的基础上，所用的样本为不同醋酸菌发酵制得的海棠果果醋，采用模糊数学法对果醋样本进行细致客观的感官评定［2］，再采用固相微萃取的方法对海棠果果醋的香气成分分别进行提取，通过气相色谱质谱法(GC/MS)对其分析研究，得出海棠果果醋香气中主要特征物质的成分，结合果醋感官评定的结果，尝试揭示不同菌种发酵对海棠果果醋风味品质的影响，同时也为我国建立海棠果果醋香气指纹图谱提供一定的理论基础。

1 材料和方法

1.1 原料

实验所用的果醋样本为经过工艺优化的实验室自酿果醋，菌种选用醋酸菌属中具有代表性的两大类醋酸菌，氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)和巴氏醋酸杆菌(Acetobacter pasteurium)，其中，巴氏醋酸杆菌适合高温发酵(30℃以上)，能氧化酒精产生醋酸［3］;氧化葡萄糖酸杆菌适合低温发酵(30℃以下)，能将葡萄糖氧化为葡萄糖酸并可少量产生醋酸［4］，采用两种醋酸菌单菌发酵和混合发酵的方式制得3支果醋作为样本，对应的编号分别为A氧化、B巴氏、C混合。所用的醋酸菌均由石河子大学食品学院微生物实验室提供。

1.2 仪器和设备

气相色谱-质谱联用仪(6890GC/5973MS型)，美国Agilent公司，SPME萃取装置，美国Supelco公司，75 μmCAR/PDMS。

1.3 果醋样品品质分析

1.3.1 果醋样本香气SPME-GC/MS分析

样品的制备:利用顶空固相微萃取(HS-SPME)装置富集海棠果果醋香气，操作方法为:取5 g(5 mL)左右样品置于15 mL顶空瓶中，将老化后的75 μm Car/PDMS萃取头插入样品瓶顶空部分，于50℃吸附30 min，吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口，于250℃解吸7 min，同时启动仪器采集数据。选用2-辛醇为内标，添加量为5 μL。

GC-MS分析条件:分流方式为不分流，色谱柱为(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。升温程序为40℃，保持3 min，以5℃/min的升温速度升至230℃，保持7 min。载气为He，体积流量为0.9 mL/min，进样口温度为250℃，检测器温度为280℃。

质谱条件:连接杆温度280℃，升温程序同上，柱头压10 psi，电离方式EI源，电离电压70 eV，倍增器电压1 000 V。扫描范围为33～450 amu。

1.3.2 果醋样本感官分析

果醋样本的感官分析采取模糊数学感官分析法，由10名专业评定人员组成评定小组，通过对3支果醋样本观察发现，3支样本在外观方面没有明显差异，测得色差和透光率的数据也几乎一样，所以在做感官评定时，不考虑果醋的色泽和品相，只对3支果醋的香气和滋味这两个属性进行感官评定，并对香气和滋味这两个属性进行细分，将香气分为水果型香气和发酵型香气，将滋味分为具有海棠果原果汁风味和具有刺激性酸味。以优、好、良、差为评语集(评定标准见表1)，采用模糊数学评价方法对其进行分析，模糊关系综合评判集Y=X·R，其中X为权重集，R为模糊矩阵。具体操作如下:

1.3.2.1 海棠果果醋因素集和评语集

因素集 U={u1，u2，u3，u4}={水果型香气，发酵型香气，海棠果原果汁风味，刺激性酸味};

评语集={优秀，较好，良，差};其中，优秀(91～100分)，较好(81～90分)，良(71～80分)，差(≤60分)。

1.3.2.2 权重确定

采用感官评定法确定果醋各感官指标权重分配，由10名专业评定人员对果醋中水果型香气，发酵型香气，海棠果原果汁风味，刺激性酸味4个指标的重要性打分，4个指标评分总和为100。评定结果见表2。

表1 海棠果果醋感官评定标准Table 1 Crabapple fruit vinegar sensory evaluation criteria

表2 权重感官评定结果Table 2 Weights sensory evaluation results

计算4个感官指标的权重，以水果型香气为例，权重为:19/100=0.19;

同理，发酵型香气权重:27/100=0.27;海棠果原果汁权重:17/100=0.17;刺激性酸味权重:38/100=0.38。即权重集 X={0.19，0.27，0.17，0.38}，归一化后得权重集 X={0.20，0.30，0.15，0.35}，总和为1。

1.3.3 果醋样本理化及微生物指标测定

总酸:碱液滴定法;总糖:斐林试剂法;pH:高精度pH计;酒精度:蒸馏法;总酯含量:蒸馏皂化法;菌落总数:≤100 CFU/mL;大肠杆菌:≤5 MPN/dL;致病微生物:不得检出。果醋样本理化及微生物指标见表3。

1.3.4 果醋理化及微生物指标检测结果

表3 海棠果果醋理化及微生物指标检测结果Table 3 Crabapple fruit vinegar physical，chemical and microbiological indicators test results

1.4 数据分析

利用随机Xcalibue工作站NIST 2005谱图库标准谱库自动检索各组分质谱数据，结合有关文献进行人工谱图解析，按照内标添加量计算出各组分的相对含量(μg/mL)。只报道正反匹配均大于800的鉴定结果。

2 结果与分析

2.1 感官评定结果分析

按照评价规则和标准，10位感官评定员对采用不同菌种发酵的3份果醋样品进行细致的对比和客观的评定，结果见表4。

根据表4中的数据可以得到3个样品各自的模糊矩阵为 R1，R2，R3。

表4 不同菌种发酵果醋样品的感官评定结果Table 4 Different strains fermented vinegar samples sensory evaluation results

2.2 确定模糊关系综合评判集

同理得 Y12=0.3，Y13=0.35，Y14=0.2，得 Y1=(0.15，0.3，0.35，0.2)，从中可以得到模糊数学关系综合评判的峰值为0.35，与原假设相比，可知A氧化的综合评定级别为良(71～80分)。

同理可得 Y2=(0.3，0.35，0.2，0.1)，归一化后得 Y2=(0.32，0.37，0.21，0.1)

得到模糊数学关系综合评判的峰值为0.37，与原假设相比，可知B巴氏的综合评定级别为好(81～90分)。

同理可得 Y3=(0.35，0.3，0.2，0)，归一化得 Y3=(0.41，0.35，0.24，0)得到模糊数学关系综合评判的峰值为0.41，与原假设相比，可知C混合的综合评定级别为优秀(91～100分)。

通过模糊数学法感官评定，对比3支果醋样本的模糊数学关系综合评判峰值可以看出，峰值大小关系为R3＞R1＞R2，说明在感官评定中，混合发酵果醋的综合评价最高，其次是巴氏醋酸杆菌果醋，最后是氧化葡萄糖酸杆菌果醋。从感官评定的结果看出果醋在感官品质上的区别主要体现在由发酵而产生的香气特征方面，这些香气特征则由香气成分的组成、数量、感官阈值以及香气物质之间相互协调作用决定［5］，因此仅从感官评定的结果并不能有效地体现出不同菌种发酵对果醋风味品质具体的影响，需要借助顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用(GC/MS)分析海棠果果醋香气成分，进一步讨论果醋香气成分之间的内部联系。

2.3 CG-MS气质联用技术分析结果

用顶空固相微萃取与气相色谱-质谱联用技术对3支海棠果果醋样本的香气成分进行分析，总离子流色谱图见图1，从3支果醋总离子流色谱图可以看出，3支香气成分保留时间和相对含量均存在差异，各组分质谱经计算机谱库检索及资料分析得出的香气成分，结果见表5。

图1 三支果醋样本总离子流色谱图Fig.1 Three vinegar sample total ion chromatogram

表5 三支果醋样本GC/MS分析结果表Table 5 Three vinegar sample GC/MS analysis of the results

2.4 海棠果果醋香气组成及主要香气成分特点分析

通过表5看出，在3支果醋样本的香气成分中，主要以酯类、醇类、酸类、烃类、酚类和醛酮类为主，氧化葡萄糖酸杆菌发酵的果醋中共鉴定出75种香气成分，确认匹配有32种，其中酯类(22.059 μg/mL)、醇类(22.755 μg/mL)、有机酸(8.155 μg/mL)、烃类(0.016 μg/mL)、酚类(0.137 μg/mL)、醛酮类(0.066 μg/mL);巴氏醋酸杆菌发酵的海棠果果醋中共鉴定出84种香气成分，确认匹配有44种，其中酯类(35.66 μg/mL)、醇类(30.616 μg/mL)、有机酸(12.33 μg/mL)、烃类(0.191 μg/mL)、酚 类 (0.159 μg/mL)、醛 酮 类(0.085 3 μg/mL);采用混合发酵的果醋中鉴定出92种香气成分，确认匹配有45种，其中以酯类(40.808 μg/mL)、醇类(31.908 μg/mL)、有机酸(18.008 μg/mL)、醛酮类(0.207 μg/mL)、烃类(0.061 μg/mL)、酚类(0.252 μg/mL)。在所有检测出的香气成分中，含量最为丰富的成分是酯类、醇类和酸类，其中相对含量较高的成分(＞1 μg/mg)有9种，分别是乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、乙酸异戊酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯、乙醇、异戊醇、苯乙醇、乙酸，这几个成分在 A氧化、B巴氏、C混合中均含有，分别为6、8、7种，只是含量上有差异，总相对含量分别为 48.72 μg/mg g、74.16 μg/mg、86.12 μg/mg，分别占3支果醋样本总香气成分的91.6%、93.8%、93.9%，其中乙酸乙酯、乙醇、异戊醇、苯乙醇、乙酸在3支果醋样本中含量均＞1 μg/mg，乙酸苯乙酯、乙酸异戊酯在 B巴氏、C混合中含量 ＞1 μg/mg，B巴氏中癸酸乙酯含量＞1 μg/mg，A氧化中辛酸乙酯含量＞1 μg/mg。这些含量较高的成分很有可能决定着果醋的主要风味特征，其中，乙酸乙酯含量高且具有浓烈的水果香气，容易挥发，故乙酸乙酯很有可能主导海棠果果醋的香气特征;乙醇是酒精发酵阶段的主要产物，乙醇本身的香气柔和、甜润，但是阈值较大［6］，可能对果醋的呈香起一定作用;乙酸又名醋酸，含量在3支果醋样本中排第3，乙酸具有酸味，乙酸是果醋中酸味和刺激性口感的主要来源;少量的异戊醇具有类似于水果香和花香的气味;苯乙醇是一种芳香烃的衍生物，具有浓郁花香味;乙酸异戊酯具有较强的类似苹果的香味;乙酸异戊酯对海棠果果醋原果香味有一定的提升作用;乙酸苯乙酯可用于配制玫瑰香精;辛酸乙酯具有白兰地香型香气，用于配制食用香精;癸酸乙酯在B巴氏中含量远高于其他两支果醋样品，其具有椰子香型香气，在一定程度上可以有效提升B巴氏的果香味。由于这9种物质含量高且具有各自独特的香气特征，所以很可能是海棠果果醋中的主要香气成分。

2.5 海棠果果醋香气成分分类分析

2.5.1 酯类

酯类化合物的形成过程主要是在发酵和陈酿过程中果醋中有机酸与醇发生酯化反应形成的，在这3支果醋样本中，除了之前提到的5种含量较高的酯类物质，3支海棠果果醋中还分别有5、10、10种酯类物质，其中，乙酸异丁酯具有柔和水果酯香味，正己酸乙酯是无色液体，有香气，在3支果醋样本中均含有，并在B巴氏、C混合中含量较多;肉豆蔻酸乙酯可用于食用香精、酒用香精中，壬酸乙酯具有强烈的葡萄香气，还有果香和酒香，均只在A氧化中存在，但含量很少，对果醋香气提升作用可能不明显;苯乙酸乙酯有浓烈而甜的蜂蜜香气、玫瑰花香和果香香气，只在B巴氏、C混合中含有，含量不高，对香气的提升作用有限;乙酸糠酯用于配制带果香的食用香精，如饮料、糖果等，只在C混合中存在，含量较低，对香气提升的帮助不大。总体上来看，酯类化合物在果醋中的相对含量很高，并且酯类化合物本身属于挥发性强、气味强烈的物质，因此酯类化合物很有可能是构成果醋香气特征风味的主导成分。

2.5.2 醇类

醇类物质的含量在3支果醋样本中仅次于酯类，除乙醇、异戊醇和苯乙醇外，3支果醋样本还分别含有8、9、8种醇类物质，其中具有代表性的香气成分有:香茅醇是最常用的香料，最适用于玫瑰香，也可作柑橘香的香精和许多香茅醇酯类的原料，在3支果醋样本中都存在且含量相似，可以起到给果醋增香的作用;金合欢醇只在 B巴氏、C混合中含有，其主要用作丁香、玫瑰等花香韵香精的调合料，也有一定增香的功能。虽然醇类在果醋中含量很高，但真正具有香气特征的成分并不多，由于醇类都是果醋酒精阶段发酵或者蛋白质水解过程中氨基酸脱羧而形成的产物［7］，故醇类物质的存在除了提供给果醋一个圆润的口感外，在香气特征方面的影响较酯类物质要小。

2.5.3 酸类

酸类物质含量在果醋中排第3，其中醋酸的生成是果醋生产的主要环节。从乙醇氧化为醋酸分为两个阶段:由乙醇在乙醇脱氢酶的催化下氧化成乙醛，再由乙醛吸水形成乙醛水化物，接着由醛脱羧酶氧化成醋酸，由于样品果醋未经过后熟，各种反应并不发生完全，经过后熟之后，酸类物质的含量可能还会有所上升。其他酸类物质如9-癸烯酸、异丁酸、辛酸，在3支果醋样本中均存在，9-癸烯酸呈显著脂肪酸和蜡香，略有果香和乳香;异丁酸具有香味，可用作食用香料;辛酸具有香味，是允许使用的食用香料。另外在B巴氏、C混合中还含有月桂酸，具有月桂油香味。酸类物质一般都具有较为强烈的刺激性口感，果醋中酸类成分对香气的提升远不如其对果醋口感的影响。

2.5.4 醛酮类及烃类

醛酮类在3支果醋样本中分别只有2、6、5种，总含量也分别只有 0.066 μg/mL、0.085 3μg/mL、0.207 μg/mL，其中3-羟基-2-丁酮和5-甲基呋喃醛在 B巴氏、C混合中均含有，前者呈现甜样的焦糖气味并带有果甜味，后者可作为烟用香精;壬醛在含量较低的情况下呈现浓郁的花香味，在3支果醋样本中都含有，但在C混合中较多;突厥酮和香叶基丙酮只在C混合中含有，前者具有甜的果香、青香、花香、木香和浆果香气，后者可用于食品香精;仲辛酮、糠醛和十八醛只在B巴氏中含有少量，其中仲辛酮可作为食品香料，糠醛具有焦香气味和甜样焦糖气味，十八醛具有椰子型香气，略有茴香音韵，稀释后有杏、李子香气;烃类只有三氯甲烷这1种物质，三氯甲烷易挥发，味辛甜并有特殊芳香气味，在3支果醋样本中均含有，可以看出，醛酮类及烃类物质虽然含量不高，种类较少，但是这些物质却极具香气特征，它们可能在一定程度上会增加或者辅助海棠果果醋的主体香气［8］。

2.5.5 酚类

3支果醋样本中检测出并符合条件的酚类物质只有两种，分别为丁香酚和对乙烯基愈疮木酚，其中丁香酚有强烈的丁香香气，可用于香水香精以及各种化妆品香精和皂用香精配方中，还可以用于食用香精的调配;对乙烯基愈疮木酚有特殊芳香气味，可用作生产香料，3支果醋样本中均含有这两种物质，C混合中含量较多，可以看出，这两种物质虽然含量较少，但是香气特征明显，很可能对果醋的主体香气具有辅助作用。

3 结论

(1)采用模糊数学法对不同菌种发酵的海棠果果醋进行感官评定，其中模糊数学综合评定峰值大小为:R3＞R1＞R2;最后的感官评定结果为:A氧化的综合评定级别为良(71～80分)，B巴氏的综合评定级别为好(81～90分)，C混合的综合评定级别为优秀(91～100分)。

(2)采用GC-MS气质联用技术分析了3种海棠果果醋的香气成分，发现海棠果果醋中香气成分种类非常丰富，主要有醇类、酯类、有机酸类、杂环类化合物、烃类以及酚类等，通过对3种果醋中的有效香气成分进行分析发现，相对含量较高(＞μg/mg)的成分均为酯类、醇类或者酸类，总含量均占3支果醋样本香气成分总含量的90%以上，可以推断，这些物质可以看作是海棠果果醋的主要香气成分，这些物质共同构成了海棠果果醋的主体香气，其他含量较少的物质也在一定程度上增加或辅助了海棠果果醋的香气特征，正是由于这些物质之间协同作用、共同协调，才形成了海棠果果醋独特的风味品质。

(3)不同菌种发酵对海棠果果醋的风味品质确实有明显的影响，通过GC/MS分析，知其原因很可能与不同醋酸菌发酵过程中形成的产物在种类和含量上不同有关，其中有些物质通常具有独特的香味或者可以辅助其他物质发挥出香气，这从根本上决定了不同菌种发酵的海棠果果醋在风味品质上的差别，巴氏醋酸杆菌由于醋酸和酯类的转化率高，所以制得的果醋在感官上要好于采用氧化葡萄糖酸杆菌发酵的果醋，而这两种醋酸菌混合发酵制取的海棠果果醋无论是理化检验指标和感官评定结果，还是物质利用率、产物转化率以及发酵效率，相比单菌发酵都有明显提高，与同类的市售果醋饮料相比也具有一定的优势。

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