不同酵母与温度发酵的威代尔冰葡萄酒有机酸分析*

唐柯，王蓓，马玥，徐岩，李记明

1(食品科学与技术国家重点实验室、工业生物技术教育部重点实验室、江南大学生物工程学院酿酒微生物与酶技术研究室，江苏无锡，214122)2(烟台张裕葡萄酿酒股份有限公司，山东烟台，264000)

有机酸是葡萄酒中重要的组成成分之一，葡萄酒中的有机酸主要来源于葡萄果实(苹果酸、酒石酸、柠檬酸)以及发酵过程(乳酸、乙酸、琥珀酸)［1］。有机酸是葡萄酒中重要的呈味物质，是葡萄酒酸度的主要决定因素。有机酸的种类、含量和比例调节着葡萄酒的酸碱平衡，影响着葡萄酒的口感、色泽及生物稳定性［2］。

冰葡萄酒是采用特殊酿造工艺酿造的葡萄酒。它是将葡萄推迟采收，在-8℃的气温下，果实挂在枝头通过自然结冰和风干，葡萄中的糖分得到高度浓缩，在结冰的状态下压榨、低温保糖发酵酿制而成的甜型葡萄酒(VQA，1999)。酿造冰酒的过程十分缓慢，经常要花费数个月才能达到期望的酒精含量。在如此长时间发酵期内，保持其发酵安全性和品质的优异，口感的协调至关重要，因此冰酒发酵对酵母和发酵温度的选择具有特殊性。酵母种类对冰酒发酵过程中乙酸和甘油形成、发酵速度和冰酒的感官特性有显著的影响［3］。由于冰葡萄汁的含糖量高，黏度大，高糖引起的高渗透胁迫会产生一定量的乙酸，而使酒的挥发酸含量高于一般的葡萄酒［4］。因此，冰酒发酵过程的重点是保持果香，形成优雅的酒香和醇和的口感，控制挥发酸的含量。主要措施就是选择适宜的酵母菌和控制发酵温度。加拿大科学家在冰酒发酵过程中选择了7个商品酵母进行试验，结果发现酵母ST、N96和EC1118对香气和乙酸的控制最好，适合酿造冰酒［5］。Pigeau等研究了含糖量高于40°Brix的冰葡萄汁对酵母发酵的影响，结果表明随着冰葡萄汁含糖量的增加，发酵过程中产生了更多的乙酸和甘油，并且酵母生长速率和乙醇生成量都有所降低［6］。邵威平的研究发现，冰葡萄酒发酵温度为5℃时，酵母活性受到很大抑制;当发酵温度高于10℃时，随着温度的升高，发酵原酒的酒度和挥发酸明显增高，总糖、干浸出物和氨基酸含量减少，削弱了冰酒甜润醇厚的典型性［7］。

我国作为世界上仅有的几个能酿造冰葡萄酒的国家，冰酒资源优势非常明显。但是目前国内对冰葡萄酒的研究仍相对较少，而且当前的研究更多的集中于冰葡萄酒的酿造工艺及香气分析［8-10］，对于冰葡萄酒品质具有重要影响的有机酸的系统研究还尚未见报道。本文以不同酿造条件的冰葡萄酒为研究对象，通过高效液相色谱分析不同酵母不同发酵温度对冰葡萄酒有机酸含量的影响，为进一步改进冰葡萄酒酿造工艺，提高我国冰葡萄酒品质提供科学参考和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料:选用辽宁省桓仁地区产2011年份威代尔葡萄，采收时糖度为32°Brix。

酵母:EC、R2、K1、ST，白香郁均由张裕葡萄酒公司提供。

试剂:草酸、酒石酸、甲酸、丙酮酸、L-苹果酸、莽草酸、L-抗坏血酸、L-乳酸、乙酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸等12种有机酸标样购自Sigma-Aldrich公司，纯度均在99%以上。

1.2 仪器与设备

pH计，METTLER TOLEDO;恒温烘箱，上海实验仪器厂有限公司;循环水式真空泵SHZ-D(Ⅲ)，巩义市子华仪器有限责任公司;纯水仪，Millipore Simplicity UV Bedford，MA，USA;安捷伦液相色谱仪1200配有紫外检测器，美国安捷伦公司。

1.3 标准溶液的配制

分别精确称取草酸等12种有机酸0.2～0.8 g，用甲醇溶解并转移置10 mL棕色容量瓶中，用流动相定容至刻度，封口，作为标准贮备液，在-20℃保存备用。使用前，根据实验需要将此标准贮备液用流动相稀释至适宜含量，以配制标准工作液和混合标准工作液。

1.4 色谱条件

参照段云涛(2007)的方法［14］，略有改动。WATERS Atlantis T3色谱柱(4.6 mm×150 mm ID，3 μm);保护柱为 PhenomeneX RP-C18Security Guard(4.0 mm×3.0 mm)，紫外检测波长为210 nm，柱温30℃，进样量为10 μL，以峰面积外标法定量。

等度洗脱:流动相为:10 mmol/L NaH2PO4，pH 2.7;流速为0.8 mL/min。

冰葡萄酒样品与流动相按照1∶9(v/v)进行稀释，测定前经0.45 μm水相微孔滤膜过滤。

1.5 试验方法

分别在10，15，20 ℃三个温度下，接种 EC、R2、K1、ST和白香郁5种酿酒酵母进行发酵，酵母接种量统一为1×106个细胞/mL，发酵工艺参照文献［8］。发酵设备采用50 L不锈钢发酵罐，每个处理各发两罐。3个温度下5种酿酒酵母发酵的冰葡萄原酒的理化指标数据见表1。

1.6 数据处理

所有实验均重复3次，数据处理与统计分析采用SPSS 19.0分析软件进行，绘图采用SigmaPlot 12.1进行。

2 结果与分析

2.1 定性

将酒石酸、琥珀酸、乙酸、丙酮酸、草酸、L-苹果酸、L-乳酸、柠檬酸、L-抗坏血酸、甲酸、莽草酸和马来酸共计12种标准品配成混合样品，用增高法定性。结果表明，12种有机酸标准品在上述色谱条件下，能够充分分离，并且峰型锐利，分离效果较好(见图1)。

表1 不同处理条件发酵的威代尔冰葡萄原酒的理化指标Table 1 Characteristics of Vidal ice wine produced by different fermentation conditions

图1 12种有机酸标样色谱图(a)及冰酒样品色谱图(b)Fig.1 Chromatogram of twelve organic acids from a standard mixture(a)and an icewine sample(b)by HPLC

2.2 不同酿造方式对冰葡萄酒总有机酸含量的影响

对不同酵母及不同发酵温度发酵的冰葡萄酒样品中12种有机酸含量的测定结果见表2。从表2中可以看出，在所有冰酒样品中均检测到了除甲酸及抗坏血酸外的10种有机酸。在这10种有机酸中，苹果酸的含量最高，约占总有机酸的50%左右，其次乙酸、酒石酸、琥珀酸、柠檬酸的含量也较高。马来酸的含量最低，平均只有0.002 g/L左右。从总量上来看，20℃ R2酵母发酵的冰葡萄酒有机酸含量最高，达到14.515 g/L，而EC在10℃下发酵的含量最低，只有12.472 g/L。

酒石酸、苹果酸与柠檬酸是葡萄果实中自然形成的3种有机酸，也是葡萄酒中的3种固有酸;琥珀酸，乳酸，乙酸则是来自于发酵过程。通常，在葡萄酒中主要的有机酸类物质是酒石酸、苹果酸与柠檬酸［11］。Kritsunankul等人研究发现，高质量的葡萄酒往往含有较高来自葡萄果实的有机酸，而含有较低发酵过程中产生的有机酸［12］。从表2中可以，在不同酵母、不同温度下发酵的冰酒样品中酒石酸、苹果酸与柠檬酸的含量均较高。此外，因为发酵后的冰酒样品均未经过苹果酸-乳酸发酵，所以苹果酸在冰酒有机酸的含量很高，占到了总有机酸的50%左右，而乳酸的含量则非常低。影响葡萄果实中苹果酸含量最主要的因素是气候，较冷环境收获的葡萄果实中苹果酸含量更高［13］。冰葡萄后熟期环境温度较低，因此冰葡萄中苹果酸含量比普通葡萄果实更高。段云涛等人的研究中，3款来自加拿大的冰酒中苹果酸的含量范围为4.873～5.192 g/L，本实验苹果酸含量范围为6.225～6.855 g/L，略高于其检测值［14］。

琥珀酸是葡萄酒发酵过程中产生的一种重要的有机酸，琥珀酸的味感复杂，既酸又苦，也是葡萄酒所含有机酸类中最富于味觉反应的一种酸。根据Castellari等人的研究，耐冷冻沉淀、非耐冷冻沉淀酵母发酵葡萄酒中琥珀酸含量分别为1.090 g/L、0.530 g/L，可以看出不同酵母发酵会导致琥珀酸含量有较大差异［15］。Aragon等对不同酿造温度葡萄酒有机酸含量变化展开研究，葡萄酒琥珀酸含量范围为1.03～1.33 g/L，其含量变化与发酵温度没有明显联系［16］。从本研究中结果看，琥珀酸含量与发酵温度也无明显联系。

表2 不同处理条件发酵的威代尔冰葡萄原酒中有机酸含量 (n=3) 单位:g/LTable 2 The content of organic acids in Vidal ice wine produced by different fermentation conditions(n=3)

2.2.1 不同酵母对冰酒有机酸含量的影响

从图2中可以看出，在10℃的发酵温度下，EC、K1和ST产生的有机酸含量较低，白香郁有机酸含量最高;在15℃的发酵温度下，同样是ST产生的有机酸含量最低，EC和K1含量较高，两者之间并无显著性差异;在20℃的发酵温度下，ST与白香郁的有机酸含量较低，而R2有机酸含量最高。综合来看，ST在3个温度下产生的有机酸含量在5个酵母中都相对较低。

2.2.2 不同发酵温度对冰酒有机酸含量的影响

图3是不同发酵温度发酵冰葡萄酒的总有机酸含量。从图3中可以看出，5种酵母在3个不同发酵温度下对有机酸的影响不完全相同。在用EC1118、R2、K1、ST四种酵母酿造的冰酒中，总有机酸含量随温度升高而增加。而白香郁酵母酿造冰酒总有机酸含量的变化趋势则与其他4种酵母有所不同，其酿造温度为10℃时，总有机酸含量最高。综合来看，较低的温度有利于控制有机酸含量的生成。

图2 不同酵母发酵冰葡萄酒有机酸含量Fig.2 The content of organic acids fermented with different species of yeast strains

图3 不同发酵温度发酵冰葡萄酒有机酸含量Fig.3 The content of organic acids fermented with different temperature

2.3 不同酿造方式对冰葡萄酒乙酸含量的影响

从表2可以看出，在不同温度不同酵母发酵的15个冰酒样品中，乙酸含量最高的是20℃ R2酵母发酵的冰酒样品，达到2.488 g/L;最低的是10℃下ST酵母发酵的冰酒样品，乙酸含量只有1.316 g/L。此外，在不同发酵温度下乙酸与总有机酸含量变化趋势基本一致，酿造温度越高，乙酸含量越高，较低的发酵温度有利于对乙酸的控制;而不同酵母发酵的冰酒样品中，ST对乙酸的控制最好，乙酸生成量最低。

乙酸是葡萄酒酿造过程的“晴雨表”，其含量的高低直接影响到葡萄酒的品质。由于冰葡萄汁的高糖浓度作用于酵母细胞壁后，会形成过高的渗透压，使酵母代谢异常，一方面使得发酵过程通常要达到数月才可以达到期望的酒精度，另一方面高糖导致的高渗透压会形成大量的挥发酸，其中最主要是乙酸［4］。较低浓度的乙酸对冰酒质量不会产生很大影响，乙酸在乙醇乙酰基转移酶的作用下和乙醇生成乙酸乙酯，它会给葡萄酒带来一定的果香味，但是高浓度的乙酸会对葡萄酒的风味产生较大影响。在加拿大，VQA(1999)关于冰酒中挥发酸的限定是最高不超过2.1 g/L。而Cliff等的研究发现，冰酒中乙酸的阈值是3.185 g/L，通常绝大多数冰酒中的乙酸含量都不会超过这个值［17］。最近一项对于加拿大冰酒的调查研究发现，在加拿大冰酒中乙酸含量范围很大，在0.49～2.29 g/L之间，但是平均水平在1.3 g/L左右，还是远远低于冰酒中乙酸的感觉阈值，不会对冰酒的风味带来较大影响［18］。表2结果可以看出，在3个温度、5个酵母发酵的15款冰酒样品中，检测到的乙酸在1.316～2.488 g/L之间，同样远低于3.185 g/L的阈值水平。

2.4 双因素方差分析

为了进一步考察发酵温度及酵母与乙酸含量之间的关系，我们通过双因素方差分析对其进行判断。表3是各主体间效应检验表及方差分析表，从各项显著性检验的P值来看，截距上温度与酵母对乙酸含量的影响，在0.05的显著性水平上是非常显著的，说明无论发酵温度还是不同的酵母对冰酒发酵产生的乙酸都有很大的影响。

表3 主体间效应的检验表及方差分析表Table 3 Tests of between-subjects effects

表4是不同温度对乙酸含量多重比较的结果，从显著性检验的结果来看，3个发酵温度两两之间都是具有显著差异的，说明3个不同的发酵温度之间乙酸含量差异很大。

表4 不同温度对乙酸含量多重比较结果Table 4 Themultiple comparisons of different temperature

表5是不同酵母对乙酸含量的多重比较结果，从分局显著性检验的结果来看，在不同酵母发酵冰酒产生乙醇含量之间，除了酵母EC与R2，EC与K1差异不显著外，剩余不同酵母之间差异都是极显著的。

表5 不同酵母对乙酸含量多重比较结果Table 5 Themultiple comparisons of different yeast strains

3 结论

本文采用HPLC分析技术测定了不同温度不同酵母酿造的威代尔冰葡萄酒中12种主要的有机酸，结果表明，在所有冰葡萄酒样品中均检测到了除甲酸和抗坏血酸外的10种有机酸，其中苹果酸含量最高，酒石酸、柠檬酸、乙酸和琥珀酸的含量也比较高，其他有机酸含量基本都小于1 g/L，马来酸含量最低，平均只有0.002 g/L。总有机酸含量随酿造温度升高而增加。较低的发酵温度有利于对乙酸的控制。ST酵母在不同发酵温度下乙酸含量均较低。

通过双因素方差分析的统计学方法，对不同酵母不同温度下发酵的15款冰葡萄酒中的乙酸含量进行分析。结果表明，无论发酵温度还是酵母种类对冰酒发酵产生的乙酸都有极显著地影响;3个不同的发酵温度之间乙酸含量差异很大;在不同酵母发酵冰酒产生乙酸含量之间，除了酵母EC与R2，EC与K1差异不显著外，剩余不同酵母之间差异都是极显著的。

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