不同方法萃取长叶橙种子油品质的比较*

孙谦，胡中海，孙志高，盖智星，黄巧娟，郝静梅

1(西南大学 柑桔研究所，重庆，400712)2(中国农业科学院，柑桔研究所，重庆，400712)

柑橘种子作为柑橘加工的副产物不仅可以用于栽培种子，更有药用价值。橘核味苦、平，具有理气、散结、止痛等功效，常用于治疗小肠疝气、睾丸肿痛、乳痈肿痛等症［1］。据研究报道柑橘种子含油量达38.9% ～58.5%［2-3］，高于棉籽(18% ～22%)、大豆(18% ～25%)和橄榄(20.0% ～25.0%)［4］等种子油脂含量;同时柑橘种子油还含有大量的柠檬苦素、黄酮、VE、植物甾醇等，是一种具有保健功能的油脂来源［3，5-6］。目前油脂萃取的主要方法有超临界CO2流体萃取、溶剂萃取、压榨和水酶法等，但不同的萃取方法对柑橘种子油脂品质的影响却鲜有报道。长叶橙是20世纪70年代中期，由重庆市果树工作者在江津甜橙中选育出的一个地方良种。它具有皮薄、油胞细、汁多、肉味独特，且种子含量丰富等特点，既可鲜食也可加工［7］。本文以长叶橙种子为实验原料，采用超临界CO2流体萃取、超声波辅助溶剂萃取、压榨机冷榨和热榨四种方法萃取长叶橙种子油，测定该油脂的初始理化性质、脂肪酸组成、柠檬苦素含量以及自氧化能力等指标，对比分析不同的萃取方法对长叶橙种子油品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

长叶橙种子，重庆江津;CO2气体(纯度 ＞99.5%)，重庆北碚光明气体厂;14%三氟化硼-甲醇溶液 CNW 公司;乙腈(色谱纯)SIGMAALDRICH.CO;无水 Na2SO4、KOH、正己烷、乙醚、无水乙醇、ICl、KI，以上溶剂均为分析纯，购于重庆川东化工有限公司化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

HA221-50-06-C型超临界CO2萃取仪，华安超临界萃取有限公司;TM-RA303家用榨油机，佛山市南海TCL家用电器有限公司;B-480旋转蒸发仪，瑞士Buchi公司;UltiMateTM3000高效液相色谱仪，美国戴安公司;Unicen MR台式高速冷冻离心机，德国Herolab公司;GZX-9240 MBE数显鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂;DP-800超声波清洗器，上海生析超声仪器有限公司;THD-1020低温恒温槽，宁波天恒仪器厂;BCD-254(KK24V45TI)双开门冰箱，博西华家用电器有限公司;6202高速粉粹机，北京燕山正德机械设备有限公司;BT 224S电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 粗脂肪含量及各方法油脂提取率

参照GB/T 5512-2008粮油检验粮食中粗脂肪含量测定。

超临界CO2流体萃取(SCF-CO2)最佳工艺参数:萃取压力27 MPa;萃取温度46℃;CO2流量33 L/h;萃取时间2.3 h。

超声波辅助溶剂萃取(UAS)工艺参数:萃取溶剂正己烷;超声功率300 W;超声时间2 h;料液比1∶8;超声温度40℃。

冷榨(CP)/热榨(HP)使用榨油机，参数设置为:油料，葵花籽;工艺，冷榨(热榨);香型，清香型。热榨需榨油机自动炒料40 min。所得油脂，置于离心管，以4 500 r/min的转速离心10 min去除杂质，计算油脂萃取率:

萃取率/%=m/m1

式中:m为不同方法萃取的油脂质量;m1为粗脂肪质量。

1.3.2 理化指标的测定

相对密度测定:GB/T 5518-2008粮油检验 粮食、油料相对密度的测定;折光率测定:GB/T 5527-2010动植物油脂，折光指数的测定;酸值测定:GB/T 5530-2005动植物油脂 酸值和酸度测定;非皂化值测定:GB/T 5535.2-2008动植物油脂不皂化物测定己烷提取法;碘值测定:GB/T 5532-2008动植物油脂碘值的测定;过氧化值:GB/T 5538-2005动植物油脂过氧化值测定。

1.3.3 柠檬苦素类物质分析

参照郭烨［8］的方法，采用高效液相色谱仪(HPLC)测定。称取长叶橙种子油1 g，精确至小数点后2位。以乙腈定容至10 mL容量瓶，混匀，静止30 min，用0.45 μm滤膜过滤，上样。色谱条件:色谱柱:MP C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5μm);柱温30℃;检测波长:210 nm;检测器:紫外检测器;流动相∶V(乙腈)∶V(水)=38∶62;进样量:20 μL;流速:1 mL/min。

1.3.4 脂肪酸组成分析

参考 Dias［9］和 AOAC［10］的方法，称取 0.5 g 油脂于15 mL具塞试管中，加入3 mL苯石油醚混合溶剂(体积比1∶1)，轻轻摇动使之溶解。再加入2 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，混匀。在45℃水浴中反应30 min。加1 mL正己烷使甲酯溶于其中，最后加适量饱和NaCl溶液使全部有机相甲酯溶液上升至试管上部。澄清后吸取上清液，装入进样小瓶中，即可用于气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析。脂肪酸的定性采用MS谱库相似度检索定性，定量采用峰面积归一化法。

气相色谱-质谱联用仪参数:DB-FFAP毛细管色谱柱(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm)，压力 100.1 kPa，总流量87.3 mL/min，柱流量1.04 mL/min，线速度38.9 cm/s，吹扫流量3.0 mL/min，不分流，进样量1 μL，载气为氦气，进样口温度250℃，柱温升温程序为:起始温度60℃，保持2 min，以12℃/min升到160℃，保持2 min，以3℃/min升到230℃，保持3 min，总程序时间37.5 min。

1.3.5 贮藏能力测定

采用Schaal烘箱法［11-12］将4种方法提取的长叶橙种子油30 mL置于50 mL烧杯中，敞口放入(60±1)℃的恒温箱中，每隔48h取油样分析，测定其过氧化值(POV)、酸值(AV)。

2 结果与分析

2.1 粗脂肪含量及各方法油脂提取率

经索氏抽提法，回流8h测得长叶橙种子含油量为33.80%，表1为4种萃取方法的油脂提取率。由表可知采用超临界CO2流体萃取油脂其提取率最高，冷榨法的油脂提取率最低。

表1 不同方法的油脂萃取率 %Table 1 Oil extraction rate of different methods%

表2 不同方法萃取油脂初始理化指标Table 2 Initial physical and chemical indicators of oil extracted by different methods

2.2 初始指标测定结果

实验结果表明，4种方法所萃取的油脂折光率及相对密度不存在明显差异(P＜0.05)，折光率与20℃条件下花生油(1.471 61)、菜籽油(1.472 87)接近［13］。4种方法所得油脂酸值均小于 4(KOH)/(mg/g)，过氧化值均小于24 mmol/kg，符合食用植物油卫生标准对植物原油的指标要求［14］。其中采用超临界CO2萃取所得油脂的酸价明显高于其他3种方法(P ＜0.05)，赵云霞等［15］也发现，超临界 CO2流体所萃取的山杏油的酸值高于冷榨，可能是CO2溶解于油脂中所致。4种方法萃取油脂的碘值均小于100，与橄榄油、茶油、花生油、椰子油、棕榈油、桕脂和大多数动物油脂一样属于不干性油脂，这类油脂的主要用途是食用，其次可以作为润滑油，纺织用油及制皂品的原料［16］。超临界流体CO2萃取油脂非皂化物质的含量明显高于(P＜0.05)其他方法，表明该油中甾醇、高分子醇类、树脂、蛋白质、蜡、色素、VE等非皂化物质含量更高。

2.3 柠檬苦素类物质测定结果

图1为柠檬苦素、诺米林标准品的高效液相色谱图，柠檬苦素的保留时间为26.8 min，诺米林保留时间为38.7 min。

图1 柠檬苦素和诺米林标准品HPLC图谱Fig.1 HPLC profiles of limonene and nomilin standard

实验得到柠檬苦素标准曲线回归方程为:Y=0.241 8X-0.028 7，相关系数为0.998，诺米林标准曲线回归方程为:Y=0.195 8X+0.019 4，相关系数为0.998 2。表3为4种方法所提油脂柠檬苦素类似物含量。其中，超临界CO2流体萃取油脂的含量最高为1.891 mg/g，溶剂萃取油脂的含量最低，仅0.166 mg/g。柠檬苦素作为柑橘种子中主要的生物活性物质，具有抑菌、抗炎、镇痛、抑制肿瘤细胞等生理功能［17-19］。温靖等人［20］发现柑桔种子中柠檬苦素类物质具有显著的抗炎镇痛作用，且没有剂量依赖关系。因此长叶橙种子油具有作为伤痛患者食用油的潜力。

表3 不同方法萃取油脂柠檬苦素类似物含量 单位:mg/gTable 3 Limonoids content of oil extracted by different methods

2.4 脂肪酸组成分析结果

表4为不同方法所得油脂中脂肪酸的组成及相对含量。分析可知，不同的萃取方法对长叶橙种子油中脂肪酸的组成及含量影响较小，其主要成分为棕榈酸(30.71% ～33.23%)、硬脂酸(11.0% ～13.77%)、油酸(34.04% ～40.63%)、棕榈油酸(3.10% ～4.80%)、亚油酸(3.95% ～13.24%)，此外还含有少量的亚麻酸(0.35% ～1.1%)和二高-γ-亚麻酸(0.19% ～0.41%)。饱和脂肪酸(SFA)与不饱和脂肪酸(单不饱和脂肪酸MUFA与多不饱和脂肪酸PUFA)比例约为1∶1。这与 matthaus等［3］研究的8 种土耳其柑橘种子油和9种越南柑橘种子油的主成分相似。除溶剂法提取的长叶橙种子油外，其余3种方法所提油脂都含有微量的二高-γ-亚麻酸(C20:3n-6c)。已有不少研究表明，二高-γ-亚麻酸作为前列腺素合成的前体，具有扩张血管的功能，是心肌梗塞的内源性保护剂［21］。

表4 不同方法所得油脂的脂肪酸组成 %Table 4 Fat acid comparison of oil extracted with different methods

2.5 贮藏能力测定结果

图2为不同方法萃取长叶橙种子油在自氧化过程中过氧化值的变化曲线。4种方法所得油脂初期过氧化值增加缓慢，144 h后增长都加快，这可能是因为油脂中不饱和脂肪酸、抗氧化物质如VE等被完全破坏被消耗导致。超临界CO2萃取油脂过氧化值增长速度均大于其他方法所得油脂，一方面与超临界CO2流体萃取油脂初始酸价较高相关［22］，另一方面超临界CO2流体萃取所得柑橘种子油的色泽明显要高于其他方法所得油脂，因此超临界CO2流体萃取油脂中可能含有更多的光敏因子。冷榨与热榨初期增长趋势一致，144 h后冷榨增长明显快于热榨油脂，这主要是由于冷榨油脂所含的水分高于热榨，在高温下对油脂的氧化起了促进作用［23］。

图2 不同方法萃取油脂的过氧化值变化曲线Fig.2 Curve of peroxide value for oil extracted by different methods

图3为不同方法提取长叶橙种子油自氧化过程中酸值的变化。4种方法所提油脂都随时间延长其酸价增高，超临界CO2流体萃取的油脂酸价明显高于其他3种方法。在测定时间范围内，4种方法所得油脂的酸价都没有超过国家对食用植物油原油的限定值4 mgKOH/g。

图3 不同方法萃取油脂的酸价变化曲线Fig.3 Curve of acid value for oil extracted by different methods

过氧化值作为限制油脂品质的重要指标之一，可以通过自氧化过程中过氧化值变化曲线推算出油脂的货架寿命。根据于修烛试验［24］可知，Schaal试验24 h相当于20℃贮藏15 d，由此可推算出超临界CO2流体萃取长叶橙种子油的货架寿命为41.7 d，溶剂萃取为71.7 d，冷榨为92.4 d，热榨为80.9 d。超临界CO2流体萃取所得油脂初始酸价较高，导致其贮藏能力下降，因此为提高油脂的品质可采取化学碱炼法、分子蒸馏脱酸法［25］、酯化脱酸法［26］、膜技术脱酸法［27］和吸附法［28-29］等方法来降低游离脂肪酸的含量。

3 结论

长叶橙种子粗脂肪含量为33.80%，超临界CO2流体萃取法萃取率最高(68.04%)。4种方法所萃取油脂的初始理化指标都符合食用植物油卫生标准，且属于不干性油脂。除溶剂提取法外，另3种方法所得油脂都含有柠檬苦素类似物，超临界CO2流体萃取油脂含量最高为1.89 mg/g。长叶橙种子油中脂肪酸的主要成分为棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸等，此外还含有微量的二高-γ-亚麻酸。其中饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比值约为1。经Schaal烘箱法测定4种方法所提长叶橙种子油自氧化能力，并推算出超临界CO2流体萃取油脂的货架期最短为41.7 d，冷榨油脂货架期最长为92.4 d。

采用超临界CO2流体萃取法时，其油脂萃取率最高，且该方法是利用无毒无味的CO2作为萃取剂，也符合目前消费者对食品安全的要求。此外，超临界CO2流体所得油脂中柠檬苦素类似物、二高-γ-亚麻酸含量都为最高值，具有作为保健油脂的潜力，但需要进一步降酸处理，以提高其贮藏能力。

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