酶联免疫吸附（ELISA）与高效液相色谱（HPLC）法检测粮谷中黄曲霉毒素B1方法比较

2015-12-25高延伟

现代食品 2015年13期

◎高延伟

（延安市食品质量安全检验检测中心，陕西延安 716000）

黄曲霉毒素（AFT）是一种毒性极强的剧毒物质，被世卫组织癌症研究机构划定为1类致癌物，在20余种黄曲霉毒素中尤以黄曲霉毒素B1（AFB1）最为危险。AFB1主要污染花生和玉米等粮谷食品，目前检测方法主要为酶联免疫吸附法（ELISA）以及高效液相色谱法（HPLC）。ELISA法操作简便快捷，但重复性较差，且易出现假阴性结果；HPLC法定量准确，重复性较好，但进样前需衍生，前处理相对复杂。本文分别采用ELISA和HPLC法检测当地粮谷食品中AFB1，并对检测结果进行比较，比较这两种检测方法各自的优缺点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈、甲醇，色谱纯；氯化钠、冰乙酸、三氟乙酸，分析纯。

AFB1标准品，含量99.0%，美国RomerLabs公司。

ELISA试剂盒，美国Helica公司，配套相应的反应试剂。

MycoSepTM228 MFC多功能净化柱，美国RomerLabs公司。

实验用水均为美国Milli-Q实验室超纯水系统制备，满足GB/T6682-2008《分析实验室用水规格和试验方法》中一级水要求。

1.2 仪器与设备

LC-20A高效液相色谱仪，附荧光检测器，日本岛津公司。

Bio-Rad 1000 PCR仪，美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 ELISA方法

称取20.0 g充分粉碎的样品于250 mL具塞锥形瓶中，加入100 mL甲醇-水（70+30）溶液后振摇30 min，经微纤维滤纸过滤过滤，收集滤液。

从恒温箱中取出ELISA试剂盒，室温下平衡30 min；加入200 μL酶标记物和100 μL标准品及待测样品提取液于稀释微孔中，吹吸混匀；转移100 μL稀释液至包被抗体的微孔中，室温下孵育15 min；吸取250 μL蒸馏水洗板三次后，加入100 μL发色剂，充分混匀后暗处孵育5 min；加入100 μL停止液，在450 nm处测量吸光度值。

1.3.2 HPLC方法

称取25.0 g充分粉碎的样品于250 mL具塞锥形瓶中，加入125 mL乙腈-水（84+16）溶液和5 g氯化钠，振荡30 min，经微纤维滤纸过滤，收集滤液。

移取6 mL滤液经MFC多功能净化柱净化后取1 mL净化液60 ℃下氮气吹干，加入500 μL衍生剂，密封混匀30 s，65 ℃衍生8 min。将衍生后的溶液在60 ℃下氮吹至干，加入200 μL乙腈-水（17+83）溶液溶解，漩涡混匀30 s，3000 r/min离心15 min，取上清液供HPLC分析。

HPLC测定条件：色谱柱：SHISEIDO C18，3.0 mm×150 mm，5 μm；柱温30 ℃；流动相：乙腈-水（17+83），0.8 mL/min；进样量：25 μL；荧光检测器：激发波长360 nm，发射波长440 nm。

2 结果与讨论

2.1 回收率及重现性

取未检出AFB1的阴性样品为空白对照，分别加入三个水平的标准溶液，按照1.3方法分别采用ELISA和HPLC法进行检验并计算回收率；同时对各加标水平进行6次平行试验，计算重现性，结果见表1。

由表1可以看出HPLC较ELISA法回收率略高，重现性较好，检测结果更加稳定，说明对于样品定量分析，HPLC法检测结果更为可靠。

2.2 ELISA与HPLC法检验结果比较

分别用ELISA和HPLC法检测20份样品中AFB1含量并计算相对偏差，结果见表2。

表1 回收率及重现验结果

表2 样品检测结果

由表2可以看出，ELISA和HPLC法检测结果差异不大，但ELISA法易出现假阳性结果。

2.3 ELISA与HPLC法前处理时间比较

以处理12个样品为例，分别记录两种检测方法所需时间。ELISA法提取样品30 min，孵育15 min，洗板3 min，显色5 min，酶标仪测定2 min，整个检测过程约55 min，平均耗时约4.58 min/样；HPLC法样品提取30 min，净化0.5 min，衍生8 min，两次氮气吹干约30 min，HPLC检测15 min/样，整个过程约249 min，平均耗时20.75 min/样。由此可知，ELISA较HPLC法更加方便快捷，适用于大批量样品的初筛。