一株饲用产脂肪酶芽孢杆菌的筛选及其紫外诱变育种

郭晓军， 郭 威， 袁洪水， 朱宝成

（河北农业大学生命科学学院，河北保定 071000）

脂肪酶，即甘油酯水解酶，在动物机体内发挥着重要的作用，能有效地促进畜禽对脂肪的消化，同时还可提供一些畜禽生长过程中必需的营养物质，如脂肪分解代谢产生的不饱和脂肪酸等（刘德海等，2012）。 Dierick 等（2004）试验表明，部分中链脂肪酸能明显抑制部分消化道有害微生物的生长，改善肠道菌落环境，从而促进消化，起到类似抗生素的作用。脂肪酶存在于动植物和微生物中，以微生物中最多，并且微生物脂肪酶比动植物脂肪酶具有更强的酸碱耐受性和温度适应性 （张树政，1984），尤其芽孢杆菌还具有较强抗逆性、易生产、易保存等优点（彭立凤，1999）。本研究拟从富含油脂的土样中筛选具有高产脂肪酶活性的芽孢杆菌，并对其进行紫外线诱变选育，以期扩大微生物脂肪酶饲料添加剂的种质资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试样品 富含油脂的土样10份，采自河北农业大学西校区附近餐厅、屠宰场。

1.1.2 培养基及主要试剂 富集培养基（100 mL）：（NH4）2SO40.1 g，NaCl 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，K2HPO40.1g，橄榄油1mL，pH7.0，121℃灭菌 15min。

溴甲酚紫显色培养基 （100 mL）：（NH4）2SO40.2 g，NaCl 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，Na2HPO40.1 g，琼脂 1.5 g，pH 7.0，121 ℃灭菌 15 min。

三丁酸甘油脂培养基：用2%的聚乙烯醇溶液与三丁酸甘油酯以1∶9比例混合制成乳化液，再将乳化液与pH 8.0的Tris-HCl溶液以1∶9比例混合均匀，加入1.5%琼脂，121℃灭菌15 min。

种子培养基（100 mL）：葡萄糖 2 g，蛋白胨2.5 g，橄榄油 1 mL，（NH4）2SO40.5 g，MgSO40.05 g，K2HPO40.1 g，pH 7.0，115 ℃蒸汽灭菌 30 min。

发酵培养基（100 mL）：葡萄糖 0.6 g，蛋白胨2 g，橄榄油 1 mL，（NH4）2SO40.1 g，MgSO40.05 g，K2HPO40.1 g，pH 7.0，115 ℃蒸汽灭菌 30 min。

菌株生理生化鉴定试剂参见 《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠和蔡妙英，2001）。

1.2 方法

1.2.1 产脂肪酶芽孢杆菌的初筛 取10份土样各取1 g分别溶于10 mL无菌水中，80℃水浴30 min，然后取1 mL混悬液加入到富集培养基中，37℃、150 r/min培养 2 d。

取1 mL富集培养液用无菌水进行梯度稀释，然后取 10-7、10-6、10-5三个稀释度液各 100 μL涂布于溴甲酚紫显色培养基平板上，37℃培养箱培养3 d后观察菌落周围形成黄色溶解圈情况。挑选产生黄色溶解圈明显的菌落于NA平板上“之”字划线纯化，挑取单菌落转接NA斜面培养基，37℃培养备用。

1.2.2 产脂肪酶芽孢杆菌的复筛 取少许37℃斜面活化菌，接种于50 mL种子培养基中，37℃、150 r/min培养18 h，然后以9%的接种量转接发酵培养基，37℃、150 r/min培养3 d。取1.5 mL发酵液，4℃、12000 r/min离心10 min。将已灭菌的牛津杯轻轻放置在三丁酸甘油酯平板上，然后注入100 μL上清液。37℃恒温放置10～12 h，测量水解圈直径并记录。

1.2.3 脂肪酶活力测定 脂肪酶活力测定方法参见橄榄油乳化法（Macrae 和 Hammond，1985）。

1.2.4 菌株的鉴定 菌株的形态学鉴定与生理生化鉴定参照 《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠和蔡妙英，2001）。菌株16S rDNA分子生物学鉴定方法参见王伟（2014）菌种鉴定方法。

1.2.5 菌株紫外诱变 对数生长期的培养液，无菌水梯度稀释至10-5，在18 W紫外灯下分别照射30、60、90、120、180、240、300 s， 照射完 4 ℃避光放置1～2 h，然后在红光下涂布初筛培养基，避光培养1～2 d。挑选周围有黄色溶解圈且形态不同的菌落，接种种子培养基，培养16～18 h，转接发酵培养基，37℃、150 r/min培养3 d，平板扩散法测定酶活力大小。将脂肪酶活力最高的诱变菌株连续传代5代培养后测定酶活力，以检测其遗传稳定性。

2 结果与讨论

2.1 产脂肪酶菌株的筛选 本试验采用溴甲酚紫显色法初筛，得到56株产脂肪酶菌株。三丁酸甘油酯平板法复筛，优选出11株具有较高脂肪酶活性的菌株。采用橄榄油乳化法测定酶活力，菌株3EA1-1酶活力最高，达36.1 U/mL。

2.2 菌株3EA1-1的鉴定

2.2.1 菌落和菌体形态特征 观察菌株3EA1-1在NA培养基中生长24 h的菌落形态。菌落成乳白色，个体适中，形状不规则，不透明，边缘呈微锯齿状，表面干燥，无褶皱，无凸起。菌株经结晶紫染色后显微镜下观察菌体形态，菌体呈杆状散在或成串分布，革兰氏染色呈阳性，芽孢呈椭圆形，中生。

2.2.2 16S rDNA分子生物学鉴定 经测序，菌株3EA1-1的16S rDNA序列长1444 bp，与Gen-Bank中所有已测定的原核生物的16S rDNA序列进行比对，选择9株相似性较高的标准菌株构建系统发育树，见图1。结果显示，供试菌株3EA1-1属于芽孢杆菌属，且与参比菌株Bacillus subtilis subsp.Subtilis和Bacillus tequilensis聚到了一起。

图1 菌株3EA1-1 16s rDNA基因进化树

2.2.3 生理生化试验 在分子生物学鉴定结果的基础上，进行生理生化试验，结果见表1。

表1 芽孢杆菌3EA1-1生理生化特性

结合供试菌株3EA1-1的形态特征、16S rDNA序列分析及生理生化特性，对照《常见细菌系统鉴定手册》，确定该菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

2.3 菌株3EA1-1的紫外诱变 由图2可见，紫外诱变后挑选菌落形态差异较大的菌株进行三丁酸甘油酯平板检测，30 s和60 s出现正突变菌株较多，其中照射30 s得到的一株突变株比出发菌株脂肪酶活力提高了40%，命名为EA-30-A。经5次传代试验，酶活力较传代前降低2.27%（P＞0.05），证明该菌株的遗传稳定性良好，是一株比较理想的脂肪酶产生菌。

图2 3EA1-1突变菌株复筛结果

3 结论

本研究采用溴甲酚紫显色法初筛，三丁酸甘油酯平板法复筛得到11株产脂肪酶较高的菌株。采用橄榄油乳化法对溶解圈较大的菌株进行酶活力测定，得到一株酶活力较高的菌株3EA1-1，酶活力达到36.1 U/mL。结合该菌株的菌落形态、菌体特征、生理生化试验结果和16S rDNA序列分析结果，鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。并采用UV对其进行单因子诱变，经三丁酸甘油酯平板筛选，选育出了一株产脂肪酶活性高的菌株EA-30-A，其酶活力较原菌株提高了40%。同时通过传代试验，证明菌株的遗传稳定性良好。

[1]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].科学出版社，2001.

[2]刘德海，解复红，贾彬，等.脂肪酶及其在饲料中的作用[J].中国饲料，2012，16：31 ～ 33.

[3]彭立凤.微生物脂肪酶的研究进展[J].生物技术通报，1999，2：17～22.

[4]王伟，王世英，郭晓军，等.β-葡聚糖酶产生菌的分离、筛选及鉴定[J].中国饲料，2014，5：17 ～ 20.

[5]张树政.酶制剂工业（下）[M].北京：科学出版社，1984.

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[7]Macrae A R，Hammond R C.Present and future applications of lipases[J].Biotechnology&genetic engineering reviews，1985，3：193 ～ 217.