QuEchERS/超高液相色谱-串联质谱法同时测定饲料中6种β-阻断剂类药物

姜光丽， 何小琴， 郗存显， 唐柏彬， 王国民*

（1.成都农业科技职业学院，四川成都 611130；2.重庆医科大学药学院，重庆渝中 400016；3.重庆出入境检验检疫局重庆市进出口食品安全工程技术研究中心，重庆江北400020）

β-阻断剂是指含氮激素的一类药物，具有芳氧丙醇胺或苯乙醇胺结构母核，苯环上连有碱性的侧链，因侧链上不同的取代基，分为不同的药物。β-阻断剂类药物在临床上常用于治疗多种原因引起的心律失常、心绞痛及高血压等 （杨宝峰等，2009），还作为动物在运输中及屠宰前的镇静用药（苗虹，2010）。过量使用该类药物在动物组织中会产生残留，食用高残留的动物组织后可影响人类的健康（田兰等，2013）。因此，进行饲料中β-阻断剂的监测，防止在畜禽养殖及运输中非法或过量使用β-阻断剂，对保障动物源性产品的质量安全非常必要。

目前β-阻断剂类药物的测定方法有流动注射化学发光法 （FI-CL）、毛细管电泳电化学法（CE-ECD）、气相色谱-质谱法（GC-MS）、高效液相色谱法 （HPLC）、高效液相色谱-质谱/质谱法（HPLC-MS/MS）等。测定的样本基质主要以肌肉、肝、肾等动物源性食品、环境水样、尿液等样品为主，净化手段主要采取固相萃取法（SPE）、分子印记技术（MIP）和固相微萃取（LPME），其中 SPE是应用最为广泛的方法。由于HPLC-MS/MS可对多组分同时进行定性和定量分析，且具有专属性强、选择性好、抗干扰能力强、灵敏度高等优势，因此对β-阻断剂类药物的分析主要采用此方法。但是，目前国内有关饲料中多种β-阻断剂药物同时测定的研究鲜见报道。

本研究采用先进的QuEchERS净化技术，通过优化提取溶剂、吸附剂的种类和用量等影响因素，利用氘代同位素内标进行定量，建立了一次提取、正离子模式扫描、UPLC-MS/MS法同时测定饲料中6种β-阻断剂类药物的新方法。该方法简便、快速、灵敏度高、重现性好、实用性强，为饲料中β-阻断剂类药物的定性定量分析提供了技术保障。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂 API4000QTRAP高效液相色谱串联质谱仪（美国ABsciex公司）；LC-30AD超高效液相色谱仪 （日本Shimadzu公司）；BS224S型天平（德国Sartorius公司）；涡旋振荡混合器（江苏康健医疗用品有限公司）；SR-2DS强力振荡器（日本Taitec公司）；3-30K台式高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；N-EVAP116水浴式氮吹浓缩仪（美国Organomation Associates公司）。

6种标准品：卡拉洛尔、纳多洛尔、阿替洛尔购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；艾司洛尔、卡维地洛购自美国Sigma公司；醋丁洛尔购自美国USP公司；卡拉洛尔-D7购自德国WITEGA公司，纯度均≥98.0%。乙腈、甲醇、异丙醇、乙酸乙酯（色谱纯，美国TEDIA公司）；乙醚（分析纯，重庆川东化工集团有限公司）；石墨化炭黑（GCB）吸附剂（美国Supelco公司）；丙基乙二胺（PSA） 、C18吸附剂（美国Agilent公司）；中性Al2O3（国药集团化学试剂有限公司）；无水MgSO4（成都市科龙化工试剂厂）。实验用水为Milli-Q超纯水系统 （美国Millipore公司）制备的超纯水。

1.2 标准溶液配制 准确称取各标准物质和内标物适量，用甲醇配制成浓度为1.0 mg/mL和0.1 mg/mL的标准物质储备液，-18℃保存。分别移取适量各标准储备液，用甲醇定容成浓度为0.5 mg/L的6种物质混合标准溶液，4℃保存。吸取一定量的混合标准溶液和内标溶液，用30%乙腈水溶液稀释成质量浓度为1～500 μg/L的混合标准工作溶液，每毫升该混合标准工作溶液含有同位素内标各20 ng，现配现用。

1.3 色谱及质谱条件 色谱条件：Acquity UPLCTMBEH C18柱 （100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：A为乙腈，B为2 mmol/L乙酸铵溶液（含0.2%甲酸），梯度洗脱程序见表 1；流速：0.30 mL/min；进样体积：5 μL；柱温：40 ℃。

表1 梯度洗脱条件

质谱条件：电喷雾正离子检测模式（ESI+），多反应监测；喷雾电压5.5 kV；雾化气压力0.45 MPa；气帘气压力0.21 MPa；辅助气压力0.41 MPa；离子源温度550℃；碰撞室入口电压为10 V。各个化合物的监测离子对（Q1/Q3）、碰撞室出口电压（CXP）、碰撞电压（CE）、去簇电压（DP）等质谱参数见表2。

表2 待测物及内标物的质谱参数和保留时间

1.4 样品前处理 称取2.0 g试样于50 mL离心管中，加入0.2 μg/L混合内标溶液0.3 mL与15 mL乙腈-甲醇溶液（3∶7，V/V），混匀后，于振荡器中振荡提取20 min，6500 r/min离心5 min，移取上清液于另一个50 mL离心管中，残留物重复提取1次，合并提取液，混匀后，移取10 mL提取液于50 mL离心管中，加入50 mg PSA和500 mg无水Mg-SO4，旋涡振荡 2 min 后，8000 r/min 离心 5 min，转移上清液于玻璃小试管中，于40℃水浴氮气吹至净干，用1.0 mL 30%乙腈溶液溶解残渣，过0.22 μm有机滤系膜，供UPLC-MS/MS分析。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化 流动相的组成对化合物的分离及离子化效率至关重要。本实验考察了乙腈、甲醇、乙酸铵等在流动相体系中的配比对目标物的分离及峰形的影响，实验表明，乙腈-2.0 mmol/L乙酸铵水溶液为流动相时，目标物的响应强度和分离度较好。同时结合甲酸可以调节流动相pH值、保持离子强度和峰形良好等特点，优化了溶液中甲酸的比例 （0.1%、0.2%、0.5%、0.8%和1.0%）及不同的梯度洗脱程序。结果表明，采用乙腈-2.0 mmol/L乙酸铵溶液（含0.2%甲酸）为流动相时，在表1所示的梯度洗脱条件下，目标物的峰形好且响应强度最大，分离度和灵敏度较高。

2.2 样品前处理条件的优化

2.2.1 样品提取条件的优化 β-阻断剂药物具有相似的母核，但是环上的取代基不同使其各自的溶解性能不一致，根据其易溶于有机溶剂的性质，实验考察了乙腈、甲醇、乙酸乙酯、乙腈-甲醇（7∶3，V/V）、甲醇-乙腈（7∶3，V/V）对目标物的提取效率。从图 1 可见，采用乙腈-甲醇（3∶7，V/V）溶液提取时，提取回收率均较高。因此，选用乙腈-甲醇（3∶7，V/V）溶液作为提取溶剂。

图1 不同提取溶剂对6种β-阻断剂药物回收率的影响

2.2.2 样品净化条件的优化 研究比较了固相萃取柱与QuEchERS吸附剂法的净化效果和回收率。结果发现，固相萃取柱的加标回收率均不理想，且重现性较差；QuEchERS吸附剂法取得了较好的净化效果。因此，本研究采用QuEchERS吸附剂法对样品进行净化。

实验分别考察了PSA、C18、中性氧化铝、石墨化炭黑（GCB）及无水MgSO4等吸附剂对目标物的吸附情况，发现C18和GCB对目标物的吸附较强，而PSA、中性氧化铝和无水MgSO4对大多数目标物吸附较少。实验进一步比较了PSA、中性氧化铝的净化效果，发现PSA的净化效果较好。因此，实验选用PSA、无水MgSO4作为吸附剂。

根据提取液中脂肪、糖分及水分的含量特点，考察了无水MgSO4和PSA吸附剂对净化效果的影响，无水MgSO4仅仅起吸水的作用，实验表明，500 mg无水MgSO4能够完全吸附提取液中的水分，且对样品净化效果和回收率的影响均不大，在固定加入500 mg无水MgSO4的情况下，优化了PSA的用量对样品净化和回收率的影响（图2）。实验最终选用50 mg PSA及500 mg无水MgSO4为净化剂组合，样品溶液澄清，基质干扰较小，回收率最佳。

图2 PAS吸附剂用量对回收率的影响

2.2.3 定容溶剂的选择 实验以流动相乙腈溶液为定容溶剂，考察了不同比例的乙腈溶液 （0%、5%、10%、20%、30%、40%、50%） 对样品残渣中目标物的溶解性能。结果发现随着溶剂中乙腈比例的增大，溶解效率相应增大，杂质相应增多，并且部分目标物出现峰分叉；当乙腈比例小于30%时，卡维地洛的溶解性较差，基本无回收率。综合考虑，选择以30%乙腈溶液定容，能使目标物充分溶解，且杂质较少，峰形较好。

2.3 方法学验证

2.3.1 线性方程、检出限及定量限 准确移取适量标准溶液，用30%乙腈溶液稀释成质量浓度为1.0、5.0、10.0、50.0、100.0、500.0 μg/L 的系列标准工作液，在最优条件下测定。以待测物与内标物峰面积的比值为纵坐标，待测物的质量浓度（μg/L）为横坐标，进行线性回归分析。由表3可知，6种β-阻断剂药物浓度为1.0～500.0 μg/L时，具有良好的线性关系，相关系数均大于或等于0.9990。

表3 6种β-阻断剂药物的线性方程、相关系数、检出限和定量限

在空白样品中，分别添加15 μg/kg的6种β-阻断剂药物，按照1.4中的方法进行样品处理后用UPLC-MS/MS分析。以信噪比（S/N≥3）和信噪比（S/N≥10）计算该方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.02～0.16 μg/kg和0.07～0.54 μg/kg。

2.3.2 方法的回收率和精密度 在空白饲料中，分别按照 5.0、10.0、20.0 μg/kg 3 个浓度水平进行添加回收实验，每个浓度平行做6份，按照1.4中的方法进行样品处理后经UPLC-MS/MS分析，计算平均回收率与RSD。6种β-阻断剂药物的总体回收率为81.8% ～119.6%，RSD为4.8%～11.3%（表4）。

表4 6种β-阻断剂药物在饲料中的平均回收率和精密度（n=6） %

2.4 实际样品的检测 按照本研究建立的方法分别对市场上的猪配合饲料、猪预混合饲料各5个样品进行分析，均未检出卡拉洛尔、纳多洛尔、阿替洛尔、艾司洛尔、卡维地洛、醋丁洛尔等6种β-阻断剂药物。

3 结论

本实验将QuEchERS净化技术应用于饲料中6种β-阻断剂药物的测定，通过优化吸附剂的类型及用量，确定出最优的净化方案，有效去除基质中的杂质干扰。试验建立的饲料中阿替洛尔、纳多洛尔、醋丁洛尔、艾司洛尔、卡拉洛尔、卡维地洛6种β-阻断剂类药物的UPLC-MS/MS测定方法简单、快捷，具有较好的应用前景。

[1]苗虹.食品及生物材料中β-激动剂和β-阻断剂残留检测技术研究及污染评价：[博士学位论文][D].中国疾病预防控制中心，2010.

[2]田兰，张继春，陈睿，等.超高效液相色谱-串联四级杆质谱法检测镇静安神类中药制剂及保健品中非法添加的9种化学药品 [J].中国药业，2013，22（6）：66 ～ 68.

[3]杨宝峰，苏定冯，周宏源.药理学（第7版）[M].北京：人民卫生出版社，2009.101.