脑出血大鼠血肿周围组织IL-17与NF-κBp65的表达及意义

脑出血大鼠血肿周围组织 IL-17与NF-κBp65的表达及意义

毕胜李冬王李鸣赵岩岩关雪莲侯丽淳田嘉莹王增冕李晓涛李培育

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154002)

摘要〔〕目的探讨脑出血大鼠血肿周围组织中白细胞介素(IL)-17与核因子(NF)-κBp65的表达及其意义。方法90只大鼠随机分成对照组，假手术组，出血组，每组30只。选取6、24 h，3、7、14 d五个时间点。RT-PCR法检测大鼠血肿周围组织中IL-17 mRNA，NF-κBp65 mRNA的表达。结果对照组与假手术组IL-17 mRNA 与 NF-κBp65 mRNA的表达在各时间点均无统计学差异(P>0.05)。在同一时间点，出血组IL-17 mRNA与NF-κBp65 mRNA的表达与对照组、假手术组均具有统计学差异(P<0.05)。在各时间点，出血组IL-17 mRNA、NF-κBp65 mRNA的表达均具有统计学差异(P<0.05)；出血组IL-17 mRNA 与 NF-κBp65 mRNA的表达在脑出血后7 d 高于其他时间点(P<0.05)。结论IL-17 mRNA 与 NF-κBp65 mRNA 的表达在脑出血后6 h 就开始增加，7 d高于6、24 h，3、14 d。IL-17 与 NF-κBp65 参与脑出血后的炎症反应。

关键词〔〕脑出血；IL-17；NF-κBp65

中图分类号〔〕R743.34〔文献标识码〕A〔

基金项目：黑龙江省自然科学

通讯作者：李培育(1980-)，男，硕士，主治医师，主要从事脑血管病的发病机制研究。

第一作者：毕胜(1981-)，女，硕士，主治医师，主要从事脑血管病的发病机制研究。

脑出血是一种常见的神经系统危重症之一。白细胞介素(IL)-17是一种重要的致炎因子，因其广泛参与多种炎症性疾病的发病而受到广泛关注。核因子(NF)-κB广泛表达于神经元，少突胶质细胞，星形胶质细胞，小胶质细胞等细胞内。NF-κB是一种具有多向性的转录调节因子，可以调控多种细胞因子的表达。大量研究证实，在多种细胞中NF-κB是IL-17A信号通路的下游靶基因〔1,2〕，本研究将通过检测IL-17 mRNA，NF-κBp65 mRNA在脑出血血肿周围组织中的表达，探讨IL-17与NF-κBp65的相关性及其在脑出血发病中作用。

1材料与方法

1.1实验动物与分组由吉林大学动物实验中心提供的清洁级SD大鼠，雄性，平均年龄(12±2)周，共90只，体重220～260 g，采用多层层流架饲养，20～25℃ 恒温饲养。随机分成对照组，假手术组，出血组，每组30只。出血组模型的制备：参考Hua等〔3〕的方法。模型成功的判定：采用Longa法评分〔4〕，无神经功能缺损为0分，出血后对侧肢体不能伸直为1 分，出现转圈为2 分，行走时身体向偏瘫侧倾倒为3 分，意识消失，完全不能行走为4 分，>2分认为模型成功。对照组模型建立方法同出血组，但只是完成刺入动作，不注入血液。假手术组模型建立方法同出血组，注入生理盐水。分别设6、24 h，3、7、14 d五个时间点。

1.2血肿周围组织IL-17 mRNA，NF-κBp65 mRNA表达模型建立后，规定时间点处死，在生理盐水灌注后即断头取脑。取血肿周围或针道周围脑组织块(3 mm×3 mm×3 mm)，用于RT-PCR法检测。采用 Trizol 法提取脑组织中总RNA。将RNA逆转录成cDNA。内参基因β-actin(PCR产物为218 bp)，上游引物:5′-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′，下游引物:5′-TGTCACGCACGATTTCCC-3′，退火温度为58℃。IL-17(170 bp)：上游引物5′-CCTCAACTCCCTTAGCTCAAAAG-3′下游引物：5′-AACTTCCCCTCAGCGTTGACA-3′，退火温度57℃。NF-κBp65(170 bp)引物序列：上游5′-ATCTGTTTCCCCTCATCTTTCC-3′，下游5′-TGGGTGCGTCTTAGTGGTATCT-3′，退火温度为58℃。通过PCR将DNA片段扩增，反应结束后，将PCR产物跑1.5%琼脂糖凝胶电泳(120 V，20 min)，凝胶成像系统分析数据。

1.3统计学方法采用SPSS13.0软件行单因素方差分析。

2结果

2.1血肿周围组织中 IL-17 mRNA 的表达对照组与假手术组IL-17 mRNA的表达在各时间点均无统计学差异(P>0.05)。在同一时间点，出血组IL-17 mRNA的表达与对照组、假手术组均具有统计学差异(P<0.05)。在各时间点，出血组IL-17 mRNA的表达均具有统计学差异(P<0.05)；出血组IL-17 mRNA的表达在脑出血后7 d 高于其他时间点(P<0.05)。见表1。

2.2血肿周围组织中NF-κBp65 mRNA的表达对照组与假手术组NF-κBp65 mRNA的表达在各时间点均无统计学差异(P>0.05)。在同一时间点，出血组NF-κBp65 mRNA的表达与对照组、假手术组均具有统计学差异(P<0.05)。在各时间点，出血组NF-κBp65 mRNA的表达均具有统计学差异(P<0.05)；出血组NF-κBp65 mRNA的表达在脑出血后7 d 高于其他时间点(P<0.05)。见表2。

表1　各组血肿周围组织中 IL-17 mRNA/β-actin 的表达

与对照组比较：1)P<0.05；与假手术组比较：2)P<0.05；与6 h相比较：3)P<0.05；与24 h相比较：4)P<0.05；与3 d相比较：5)P<0.05；与7 d相比较：6)P<0.05；下表同

表2　各组血肿周围组织中NF-κB mRNA/β-actin的表达

3讨论

多种细胞因子参与脑出血后的病理过程。IL-17因其参与多种炎症性疾病的发病而受到广泛关注，Wang等〔5〕在对体外氧糖剥夺模型鼠的研究中发现，IL-17及其受体IL-17R的表达量与脑组织损伤具有明显相关性。已有研究证实，IL-17与其受体结合后，通过NF-κB、MAPK、 JAKs/STATs这三种信号途径传导信号〔6〕。在对类风湿关节炎的研究中发现，IL-17可以间接通过多种相关细胞因子促进NF-κB的表达。而NF-κB与IL-17之间可以形成正反馈通路〔7〕。

本文发现IL-17 mRNA及NF-κBp65 mRNA的表达趋势具有明显的一致性。脑出血后炎症反应以3～7 d最为严重，IL-17 mRNA及NF-κBp65 mRNA的表达与脑出血后血肿周围组织的炎症反应过程具有高度一致性。提示脑出血后，IL-17/NF-κB 通路参与脑出血后的病理过程。可以通过调控 IL-17 的分泌达到减轻炎症反应，控制脑水肿，减少细胞凋亡的作用。

4参考文献

1Doreau A,Belot A,Bastid J,etal.Interleukin 17 acts in synergy with B cell-activating factor to influence B cell biology and the pathophysiology of systemic lupus erythematosus 〔J〕.Nat Immunol,2009;10(7):778-85.

2Shalom-Barak T,Quach J,Lotz M.Interleukin-17-induced gene expression in articular chondrocytes is associated with activation of mitogen activated protein kinases and NF-kappaB 〔J〕.J Biol Chem,1998;273(42):27467-73.

3Hua Y,Schallert T,Keep RF,etal.Behavioral tests after intracerebral hemorrhage in the rat 〔J〕.Stroke,2002;33(10):2478-84.

4Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats 〔J〕.Stroke,1989;20(1):84-91.

5Wang DD,Zhao YF,Wang GY.IL-17 potentiates neuronal injury induced by oxygen-glucose deprivation and affects neuronal IL-17 receptor expression〔J〕.J Neuroimmunol,2009;212(1-2):17-25.

6孙创斌,胡晋红.药物作用新靶点:白细胞介素 17 及其受体〔J〕.国际药学研究杂志,2008;35(3):169-72.

7Onishi RM,Park SJ,Hanel W,etal.SEF/IL/7R(SEFIR)is not enough:an extended SEFIR domain is required for i1-17RA-mediated signal transduction〔J〕.J Biol Chem,2010;285(43):32751-9.

〔2013-12-19修回〕

(编辑苑云杰)