不同程度间歇性低氧对大鼠不同脑区Bax、Bcl-2表达的影响

不同程度间歇性低氧对大鼠不同脑区Bax、Bcl-2表达的影响

赵雅宁王红阳1李琳1马素慧

(河北联合大学康复医学院，河北唐山063000)

摘要〔〕目的观察不同程度间歇性低氧后大鼠不同脑区Bax、Bcl-2表达变化，探讨阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)神经损伤机制。方法30只雄性SD大鼠随机分成对照组、轻度间歇低氧组、重度间歇低氧组各10只。对照组暴露于空气中，间歇低氧组分别暴露于不同低氧条件下(100 ml/L和50 ml/L，暴露时间每天8 h，持续时间2 w和8 w)。光镜观察额叶皮质、纹状体、海马区和小脑神经细胞结构变化，免疫组化检测上述区域Bax、Bcl-2表达变化。结果与对照组比较，随低氧时间的延长，两组间歇性低氧组大鼠额叶皮质、纹状体、海马区和小脑神经细胞区死亡神经元密度增高；Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05)；上述变化在重度间歇性低氧组最为显著(P<0.05)；轻度间歇性低氧组各脑区死亡神经元密度、Bcl-2/Bax比值变化差异显著，以额叶皮质和海马最明显(P<0.05)；重度间歇性低氧组各脑区死亡神经元密度、Bcl-2/Bax比值变化差异显著，以皮质、海马和纹状体区最明显。结论间歇性低氧可引起不同脑区Bcl-2和Bax差异性表达、神经细胞差异性丢失；皮质、海马和纹状体对间歇性低氧损伤更敏感。

关键词〔〕低氧；凋亡；Bcl-2；Bax

中图分类号〔〕R563.3〔

基金项目：河北省科技厅资助项目(No. 09276103D-11)

通讯作者：王红阳(1958-)，女，教授，博士，主要从事呼吸病学研究。

1河北联合大学附属医院

第一作者：赵雅宁(1974-)，女，博士，副教授，主要从事呼吸病学研究。

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS) 患者睡眠时反复出现不同程度的低氧血症和(或)高碳酸血症，最终引起全身多系统、多器官的渐进性损害。临床资料显示OSAHS可造成患者警觉、执行能力和运动协调方面的认知障碍，而智能、语言障碍属于相对较轻〔1,2〕。在整个认知形成过程中，脑内各个脑区发挥的作用并不相同，如额叶和基底节与人类高级认知即执行功能密切相关；纹状体主要对运动和技巧进行协调。本研究在参考其他学者慢性间歇性缺氧模型基础上，利用实时氧监测的反馈信号模拟临床呼吸暂停事件的真实状态，研究不同间歇性低氧状态下不同脑区脑组织形态、Bax、Bcl-2表达。

1材料和方法

1.1实验动物、试剂及仪器雄性SD大鼠60只〔(北京维通利华公司，合格证SCXK(京)2002-003)〕，体质量310～350 g；Bax和Bcl-2试剂盒购自中杉生物有限公司(北京)；测氧仪(建德市梅城电化分析仪器厂)；低氧控制程序(天津医科大学总医院呼吸科)；纯氮(天津六方气体高科技有限公司)；低氧舱(天津医科大学研制)。

1.2动物分组和模型制备30只雄性SD大鼠随机分成对照组、轻度间歇低氧组(暴露低氧条件100 ml/L，轻度组)和重度间歇低氧组(暴露低氧条件50 ml/L，重度组)各10只。间歇低氧组每天8:00～16:00将实验动物置于模型舱内，向舱内循环充入氮气和空气，每次循环2 min，连续给予氮气30 s，分别维持舱内氧浓度最低至10%和5%(100 ml/L和50 ml/L)，随后均复氧至氧浓度21%。对照组持续充入压缩空气。用数字测氧仪监测舱内氧浓度变化，使舱内氧浓度维持在各自的氧浓度内，使其氧浓度波动范围在±0.5%以内。实验结束将实验动物取出，送入常规饲养箱内自由饮水与摄食，生活环境及饲养条件相同。各组每天实验8 h,实验持续时间为2、8 w。对照组暴露于正常空气中；分别在实验第2、8 w进行所设指标检测。

1.3脑组织形态结构观察光镜(H-E染色)：各组个时间点5只动物，在规定时间点以戊巴比妥钠麻醉(40 mg/kg),用40 g/L多聚甲醛经左心室灌注固定后取脑,后固定24 h ,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋，切片,片厚5 μm。切片二经甲苯脱蜡,梯度乙醇降至水, 苏木精-伊红染色。每只鼠连续3张冠状背侧海马切片，采用图像分析仪(美国Bio-Rad公司)计数正常神经元，取均值。

1.4免疫组织化学法检测Bax和Bcl-2常规麻醉动物，开胸、暴露心，4%多聚甲醛行心灌流，断头取脑，在视交叉后1、6 mm处冠状面切开，取中间块入4%多聚甲醛固定液固定，石蜡包埋，切片(片厚5 μm)。切片常规脱蜡至水，枸橼酸盐微波修复，分别滴加Bax或Bcl-2抗体(1∶200)， 湿盒中4 ℃过夜，IgG抗体-HRP多聚体(PV 二步法)，37 ℃温箱 30 min，DAB 显色，脱水、透明、封片。以 PBS代替一抗作阴性对照。镜下观察并摄片。阳性率的定量分析: 每个标本取 4张切片，每张切片在海马随机选取 4 个视野，用Motic Med 6.0数码医学图像分析系统分析其积分光密度(IOD)值的大小来表示,并作为分析对象进行比较。

1.5统计学处理应用SPSS17.0软件进行方差分析。

2结果

2.1病理结果光镜：对照组额叶皮质、纹状体、海马区和小脑神经细胞形态基本结构正常，排列整齐致密，偶见变性坏死的神经元；轻度和重度间歇性低氧组中，随缺氧时间延长神经元结构出现明显损伤改变，表现为细胞变性水肿和死亡形态的神经细胞。与对照组比较，两组间歇低氧组额叶皮质、纹状体、海马区和小脑区死亡神经元密度随缺氧时间延长明显增加(P<0.05)；重度组和轻度组比较，脑区存死亡经元密度进一步增加(P<0.05)；轻度组各脑死亡活神经元密度比较差异有统计学意义，以额叶皮质和海马区最明显；重度组各脑区死亡神经元密度比较差异有统计学意义(P<0.05)，以额叶皮质、海马区和纹状体最明显。见表1。

组别额叶区海马区纹状体小脑区对照组2w1.36±0.581.38±0.581.43±0.581.42±0.568w1.42±0.581.37±0.571.41±0.481.36±0.58轻度组2w4.60±1.601)5.50±1.871)2.97±0.761)3)2.78±0.691)3)8w7.68±2.731)9.95±3.861)5.36±1.541)3)4.48±1.701)3)重度组2w9.03±2.781)2)10.56±3.231)2)8.48±2.731)2)3)6.36±1.581)2)3)4)8w12.85±3.961)2)13.70±3.361)2)12.10±4.101)2)3)9.42±2.821)2)3)4)

与对照组对应时间点比较:1)P<0.05；与轻度组对应时间点比较:2)P<0.05；与同组同时间点额叶区比较:3)P<0.05；与同组同时间点纹状体比较:4)P<0.05，下表同

2.2Bax和Bcl-2免疫组织化学结果显微镜下观察Bax、Bcl-2阳性细胞呈棕黄色，胞质着色；对照组额叶皮质、纹状体、海马区和小脑偶见阳性细胞出现；轻度和重度组中，随缺氧时间延长Bax和Bcl-2均表达增高。与对照组比较，间歇低氧组额叶皮质、纹状体、海马区和小脑区Bcl-2/Bax比值均增加，但随缺氧时间延长明显降低(P<0.05)；重度组和轻度组比较，脑区Bcl-2/Bax比值进一步降低(P<0.05)；轻度组各脑区Bcl-2/ Bax比值比较差异有统计学意义(P<0.05)，以额叶皮质和海马区最明显；重度组各脑区Bcl-2/ Bax比值比较差异有统计学意义(P<0.05)，以额叶皮质、海马区和纹状体最明显(表2)。

组别额叶皮质海马区纹状体小脑区 对照组2w0.242±0.0300.25±0.0420.232±0.0510.223±0.0628w0.233±0.060.243±0.0710.244±0.0620.234±0.052 轻度组2w3.791±1.1241)3.670±1.3641)5.936±1.1281)3)7.423±1.1461)3)8w2.689±0.8261)2.382±0.8431)4.048±1.0061)3)5.366±1.1081)3) 重度组2w2.399±0.7621)2)2.147±0.5861)2)3.408±0.3121)2)3)5.415±0.8251)2)3)4)8w1.592±0.4901)2)1.382±0.6261)2)2.208±0.3721)2)3)3.842±0.6731)2)3)4)

3讨论

以往的研究多是针对脑内某一部位损伤后患者出现某种认知障碍的变化，实际上，认知形成过程中不同脑区相互协调，相互影响。例如额叶处于额叶-纹状体环路的调控中心，其损伤后患者解决问题的技巧最容易受到影响和损伤，而基底节通过输出核(苍白球、丘脑底核、黑质网状结构)经腹外侧丘脑传送信息至运动皮质，完成一般躯体调控、动眼调控、边缘调控和前额叶调控等功能，其损伤后亦可出现认知活动中的信息加工困难〔3～5〕。本研究结果提示一方面间歇低氧对神经组织的损伤大脑皮层大于小脑等其他部位，同时不同程度间歇性低氧诱导不同脑区神经细胞死亡程度是不同的，这可能是OSAHS患者存在不同程度和性质的认知功能障碍的主要原因之一。

Bcl-2/bax是Bcl-2家族中一对重要因子，二者比值的变化是决定细胞凋亡敏感性的变阻器〔6〕。研究已经证实Bax与线粒体ANT作用使MPTP开放、线粒体膜的通透性增加、Cytc释放、细胞凋亡，而Bcl-2通过调节线粒体内外膜之间基质的pH值，增加质子流出，提高钙离子缓冲力，稳定线粒体膜结构，维持线粒体跨膜电位来抑制细胞凋亡〔7，8〕。此外Bcl-2表达可引起细胞核谷胱苷肽(GSH)的积聚，导致核内氧化还原平衡的改变，保持缺氧/复氧细胞线粒体成分完整，促进ATP再生，抑制细胞凋亡〔9〕。本研究结果提示间歇性低氧早期，抗凋亡的保护性作用占优势;而随时间延长和程度的加重,两者比值下降,神经元受损程度也逐渐加重,趋于死亡，本研究推测不同脑区Bcl-2和Bax蛋白含量增加以及两者比值失衡，导致不同脑区神经元发生凋亡、丢失，存活神经元密度降低的机制之一。

总之，本实验证实了不同程度间歇性低氧导致额叶皮质、海马区，纹状体和小脑部位神经细胞丢失，Bcl-2和Bax参与间歇性低氧神经损伤过程；Bcl-2和Bax在不同脑区差异表达和不同脑区神经细胞丢失的差异性可能在一定程度上解释了OSAHS患者认知功能损害的原因。

4参考文献

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7Prempumar A,Simantov R. Mitochrondrial voltage-dependation channel is involved in dopamine-induced apoptosis〔J〕.J Neurochem,2002;82(2):345-52.

8Vander Heiden MG,Li XX, Gottleibo E,etal. Bcl-xl promotes the open configuration of the voltage-dependent anion channel and metabolite passage through the outer mitochondrial membrance〔J〕.J Biol Chem,2001;152(22):237-50.

9Borutaite V，Brown GC.Mitochondria in apoptosis of ischemic heart〔J〕.FEBS Lett,2003;541(1-3)：1-5.

〔2012-03-15修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)