叔丁基过氧化氢体外诱导人肾小球系膜细胞的衰老

叔丁基过氧化氢体外诱导人肾小球系膜细胞的衰老

周红丽魏琳琳

(辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州121000)

摘要〔〕目的通过观察不同浓度叔丁基过氧化氢(t-BHP)作用不同时间后对人肾小球系膜细胞(HGMC)衰老指标的影响，探讨t-BHP在HGMC衰老过程中的作用。方法应用10、30、50、100 μmol/L tBHP刺激细胞，每天刺激1 h，连续5 d，刺激结束后48 h检测细胞增殖情况、衰老相关β半乳糖苷酶(SA β-gal)染色阳性细胞百分率、细胞周期变化及细胞形态改变确定t-BHP诱导HGMC衰老的最佳浓度。结果30 μmol/L tBHP刺激HGMC，每天1 h连续作用5次后可抑制HGMC增殖，且84%的HGMC SAβ-gal染色阳性，90%HGMC进入G0～G1期；光镜表现细胞体积增大、胞体扁平、胞质颗粒增多；电镜下细胞核膜内陷，染色质凝集、边集，细胞质空泡增多，出现髓样溶酶体。结论30 μmol/L tBHP刺激HGMC后每天1 h连续作用5次，可作为诱导HGMC发生衰老的刺激因素。

关键词〔〕叔丁基过氧化氢(t-BHp)；肾小球系膜细胞

中图分类号〔〕R692.3〔

基金项目：辽宁省自然科学

第一作者：周红丽(1977-),女，博士，副教授，副主任医师，硕士生导师，主要从事肾小球疾病分子机制研究。

肾脏是人体器官和系统中衰老最明显的器官。目前关于肾脏衰老的机制尚不十分明确。衰老肾脏的改变主要是由于肾小球系膜细胞(GMC)的衰老引起的。GMC表型和功能的改变在肾脏衰老进程中发挥着重要的作用。目前研究表明叔丁基过氧化氢(tBHP)可促进细胞衰老〔1～3〕，但对人GMC(HGMC)衰老的研究报道甚少。衰老的细胞丧失增殖能力，细胞周期不可逆地阻滞于G0～G1期，丧失了对有丝分裂原的反应能力，不能进行DNA合成，不能进入S期，β半乳糖苷酶(SAβ-gal)活性增高〔4〕。本研究旨在探讨t-BHP在HGMC衰老过程中的作用。

1材料与方法

1.1细胞系HGMC系购于美国Sciencell公司。

1.2主要药品和试剂HGMC培养基(美国Sciencell公司)，SAβ-gal半乳糖苷酶染色试剂盒(上海杰美基因有限公司)，四甲基偶氮唑蓝、叔丁基过氧化氢(美国Sigma公司)，胎牛血清、RPMI-1640(美国Gibco公司)，PI(上海晶美生物公司)。

1.3HGMC的传代培养HGMC贴壁生长于含2%胎牛血清的专用HGMC培养液中，在5%CO2、37 ℃和完全饱和湿度的培养箱中培养，2～3 d换液1次。用0.25%胰蛋白酶进行消化、传代。取5～8代细胞用于实验。

1.4tBHP诱导HGMC衰老浓度的确定①衰老组：10、30、50、100 μmol/L tBHP刺激细胞，每天刺激1 h，连续5 d，刺激结束后48 h进行指标检测。②对照组：细胞在不含tBHP的HGMC培养液中培养。

1.5MTT法检测细胞增殖情况取密度为103个/孔的GMC接种于96孔板中，待细胞贴壁后，换无血清培养基使细胞同步化12 h。对照组(6孔)每孔加入100 μl培养液，实验组(6孔)每孔加入含不同浓度tBHP(10，30，50，100 μmol/L)培养液100 μl刺激1 h，PBS液清洗2次后，换完全培养基。连续作用5次，作用结束后恢复48 h。于最后4 h加入5 mg/ml的MTT 10 μl/孔，放入培养箱中4 h。最后加DMSO 150 μl/孔裂解细胞，震荡10 min后酶标仪570 nm波长检测，结果用吸光度值表示。以实验组与对照组光吸收值的百分比代表存活细胞百分数。

1.6流式细胞仪检测细胞周期用0.25%的胰蛋白酶消化制成单细胞悬液。800 r/min离心5 min，弃去培养液，PBS液清洗2次。加入70%冷乙醇4 ℃固定过夜，离心去乙醇。PBS液清洗2次后，悬浮于0.5 ml PBS中，分别加入RnaseP 14 ℃避光显色30 min，上流式细胞仪对细胞周期进行检测及分析。

1.7细胞衰老SAβ-gal染色PBS液清洗细胞一次，按细胞衰老染色试剂盒说明书进行操作，染色后37℃无CO2培养3～12 h，细胞出现蓝绿色沉淀。衰老的细胞染色后呈蓝绿色，镜下随机选取6个视野分别计数衰老细胞数和总细胞数，计算SAβ-gal阳性细胞的百分率。

1.8倒置显微镜及透射电镜下观察细胞形态及超微结构改变细胞PBS液清洗2次后，置于倒置显微镜下观察细胞形态改变。0.25%胰酶消化后收集细胞，用4 ℃预冷的PBS(pH7.4)离心洗细胞2次，弃上清液，加入4 ℃预冷的2.5%戊二醛固定4 h以上，PBS液漂洗3次，每次10 min，1%锇酸4 ℃后固定2 h，漂洗3次。室温下用乙醇、丙酮逐级脱水，环氧树脂618浸透、包埋。超薄切片用醋酸铀、枸橼酸铅双染色各10 min，透射电镜观察细胞超微结构改变。

1.9统计学处理采用SPSS13.0软件进行单因素方差分析。

2结果

2.1细胞增殖情况30 μmol/L tBHP作用后，存活的细胞数为对照组的(80.12±3.25)%(P<0.05)，10 μmol/L组细胞存活率与对照组相比无显著性差异。50 μmol/L和100 μmol/L t-BHP组细胞存活明显下降，分别为对照组的(51.34±4.12)%，(49.56±3.45)%(P<0.01)。故本实验选择30 μmol/L tBHP诱导细胞衰老。

2.2SAβ-gal染色结果10、30、50 μmol/L tBHP每天1 h连续作用5次后，SAβ-gal阳性率分别为(25.22±1.23)%、(84.52±5.86)%、(90.30±6.25)%。30 μmol/L tBHP作用后，80%以上的细胞为SAβ-gal染色阳性，与对照组存在显著差异〔(23.03±0.91)%，P<0.01〕。而50 μmol/L tBHP作用后SAβ-gal染色阳性率达90%，但大部分细胞发生死亡(图1)。

2.3细胞周期检测10、30、50 μmol/L tBHP作用后G0～G1期细胞比例分别为(72.33±3.83)%，(90.01±5.62)%，(95.32±6.03)%；30 μmol/L tBHP作用后80%以上的细胞进入G0～G1期，与对照组存在显著差异〔(68.82±4.13)%,P<0.05〕。50 μmol/L tBHP虽然80%以上的细胞也进入G0～G1期，但凋亡的细胞及细胞碎屑增多。

2.4衰老HGMC光镜及电镜超微结构改变正常HGMC光镜下呈单核、梭形生长，细胞排列规则；电镜下细胞核膜平整、光滑，染色质分布均匀。30 μmol/L tBHP诱导的衰老HGMC光镜下体积增大、胞体扁平、胞质颗粒增多；电镜下细胞核膜内陷，染色质凝集、边集，细胞质空泡增多，出现髓样溶酶体。见图2，图3。

对照组

10 μmol/L tBHP组

30 μmol/L tBHP组

50 μmol/L tBHP组

图1不同浓度tBHP作用后SAβ-gal染色结果(×200)

图2　细胞光镜表现(×200)

图3　电镜超微结构改变(×6 000)

3讨论

在肾脏的衰老过程中，可出现各种形态、结构和功能上的变化，从而在临床上出现肾功能减退，肾储备能力下降及对应激的耐受能力降低等改变。目前尚无国际公认的GMC衰老模型，氧化应激是衰老的主要决定因素，活性氧在衰老相关大鼠肾变化中起重要作用，抗氧化治疗能防止衰老大鼠相关肾脏形态和功能改变。过氧化氢作为促进细胞衰老的刺激因素已在许多细胞上得到了证实，用过氧化氢或tBHP处理的成纤维细胞、脐静脉血管内皮细胞表现为细胞周期抑制、SAβ-gal染色阳性率增高等衰老表型〔5〕。本研究证实，应用tBHP作为刺激因素，可以诱导HGMC发生衰老，为临床进一步研究防治肾脏衰老提供新思路。

4参考文献

1Dumont P,Burton M,Chen QM,etal.Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast〔J〕.Free Radical Biol Med,2000;28(3):361-73.

2Unterluggauer H,Hampel B,Zwerschke W.Senescence-associated cell death of human endothelial cells:the role of oxidative stress〔J〕.Exp Gerontol,2003;38(10):1149-60.

3Chen QM,Liu J,Merrett JB,etal.Apoptosis or senescence-like growth arrest:influence of cell-cycle position，p53，p21 and bax in H2O2response of normal human fibroblasts〔J〕.Biochem J,2000;347(pt2):543-51.

4Debacq CF,Erusalimsky JD,Campisi J,etal.Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase(SA-beta gal)activity,a biomarker of senescent cells in culture and in vivo〔J〕.Nat Protoc,2009;4(12):1798-806.

5Spitelle G.Peroxidation of linoleic acid and its relation to aging and age dependent diseases〔J〕.Mech Ageing Dev,2001;122(7):617-57.

〔2013-07-13修回〕

(编辑赵慧玲)